影像的策略——从现代到后现代的视觉文化

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青岛大学硕士学位论文应用SELDI--TOF--MS技术筛选早期胃癌血清生物标志物研究姓名：李春伟申请学位级别：硕士专业：普通外科指导教师：张佃良20110517 应用SELDI-TOF-MS技术筛选早期胃癌血清分子标志物研究摘要目的：应用表面加强解吸电离一飞行时间质谱(surface-erthancodlaserdesorption／ionizationtime．of-flightmassspectrometry，SELDI．TOF．MS)技术对胃癌患者血清蛋白指纹图谱进行分析，筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，寻找更可靠的评价标准用于早期胃癌诊断和临床分型以指导个体化治疗，旨在进一步提高对肿瘤分期和预后的判断，以更好地监测治疗效果。方法：表面加强解吸电离一飞行时间质谱技术及其配套蛋白质芯片检测169例胃癌患者和83．例健康人的血清蛋白质组图谱，运用BiomarkerWizardTM和BiomarkerPatternsTM软件分析处理数据筛选具有明确临床价值的分子标记物或其组合，以进行早期分子诊断并建立胃癌诊断分类树模型。’结果：胃癌组血清与正常人血清蛋白质谱共有34蛋白表达存在统计学差异(p35岁、不良饮食习惯、肿瘤家族史及临床症状等，初筛出高危个体，再行X线摄片、内镜检查，这种普查检出的胃癌中，早期胃癌占15％一25％，且1／3无临床症状。据统计，无症状胃癌患者中半数左右手术病理证实为早期胃癌，大部分无淋巴结转移；然而有症状的胃癌患者只有33％为早期胃癌，且其中57％已经发生淋巴结转移n¨。所以对高危人群采用传统方法筛查是一项艰巨的工作，耗费巨大物力、财力、精力，效果仍欠理想。2影像学检查2．1B超检查：单纯腹部B超检查受消化道腔内气体干扰，难以诊断早期胃癌n引；胃癌只有发展到一定阶段，才能被B超检验出来，临床意义不大，不能作为临床有效诊断早期胃癌的方法。2．2X线检查。x线胃肠钡餐检查为常用的检查方法。一般常规的X线检查早期胃癌诊断率低，疑诊病例须行低张气钡双重造影检查，才能提高早期胃癌的诊断率。上消化道钡餐检查简便有效，患者容易接受，在胃癌的诊断中具有重要作用，常被作为初步检查的方法。随着双对比造影检查方法的完善，良好的双对比照影影像为显示溃疡及溃疡周围结构的微细变化提供了条件，明显提高了上消化道钡餐检查鉴别诊断疾病的能力。胃癌可以发生在胃的任何部位，胃窦发病率最高，其次胃小弯，再其次贲门；胃大弯和前壁发生率较低。胃癌的大体形态，随病期不同可分为早期胃癌、进展期胃癌。早期胃癌是指局限于粘膜层和粘膜下层肿瘤，不论其范围大小及有无淋巴结转移；可分为3型：I型隆起型，II型浅表型，ⅡI型混合型n引。在早期胃癌上消化道造影钡餐征象中，I型病变向胃腔内突出，可以形成充盈缺损；II型病变征象显示浅三角形或不规则溃疡形；III型无明显的隆起或凹陷，仅破坏胃小湾区，病变黏液有边缘不整、大小不一的颗粒状阴影或局部异常积钡，有时在俯卧位和直立充盈相时可看到边缘毛刺征，诊断较前两型困难。各型早期胃癌有时还可呈现局部胃壁僵硬，僵硬区与正常胃壁的分界明显，似刀切样。进展期胃癌又可分为中、晚期胃癌，胃癌深度超过下黏膜层，己侵入肌层者称中期，己侵及浆膜层或浆膜层外组织者称晚期n劓。胃癌有很多的病理形态分型方法，Borrmann分类法应用最为普遍，可分为4 型：①巨块型；②限局溃疡型；⑨浸润溃疡型；④浸润型。一般进展期胃癌上消化道钡餐造影表现有：①充盈缺损，多见于蕈伞型；②胃腔狭窄，胃壁僵硬，主要由浸润型胃癌引起；③龛影，见于溃疡型胃癌；④黏膜皱襞破坏、消失、中断；⑤癌瘤区蠕动消失u引。，虽然能发现大多数病变，但胃癌漏诊率较高，尤其早期胃癌漏诊率更高，其原因主要是早期恶性病变的恶性征象不明显、常规钡上消化道钡餐检查对胃粘膜的微细结构显示不足。另外上消化道钡餐检查仅能显示胃粘膜表面的病变，不能很好显示肿瘤侵犯及腹腔脏器转移的情况。胃癌的X线诊断必须结合临床，必要时行胃镜及病理组织活检检查。对于一些疑难病例，仍需结合X线、胃镜、活检等各种方法的综合诊断n酬。2．3c1．检查：在胃的CT检查中，检查前的准备工作至关重要。一般要求禁食6—8小时，于检查前5min肌注20mg654-2，使胃处于低张状态，消除胃肠蠕动造成的胃壁假性增厚及伪影。关于对比剂，目前国内外学者n7。183均主张使用方便、无味、价廉、安全的水做为阴性对比剂使用。用量应视病人状况而定，一般要求800ml左右。胃壁在饮水充盈并呈低张状态后，平均厚度为2．7±1．7mm，胃体部较薄，厚度一般为0．7-2．Omm，超过2．5mm者可视为异常。胃食管交界区和胃窦部胃壁较厚，分别在1．5-3．Omm、2．5-5．Omm，超过5．0mm多属异常。CT在胃癌中的主要表现包括：①胃壁增厚；②软组织肿块；④周围结构侵犯；④腹腔腹膜后淋巴结肿大；⑤远处转移n9】。目前传统CT检查对早期胃癌的诊断比较困难，多层螺旋CT扫描速度快，层更薄，分辨率有了明显提高，可多期扫描，清楚显示肿瘤生长、侵犯胃壁周围脏器、淋巴结及远处转移情况，更重要的是明显提高了胃癌分期的准确性及微小肿瘤的检测率‘舢¨。Moss和Cook提出阻蝴1临床上常用的CT分期参照标准。To期：胃壁没有改变，胃周脂肪层正常；T。期：单层型表现为局部胃壁增厚而没有胃壁明显强化，或只有胃壁明显强化而没有胃壁增厚；多层型表现为胃壁增厚和明显强化，但没有中外层的突然消失；T：期：单层型表现为胃壁强化并局部胃壁增厚，三层型表现为胃壁强化并胃壁中层的突然消失，两层型则为胃壁外层突然消失；增厚胃壁的边缘尚光滑，或胃周脂肪层内出现少量软组织条带：T。期：增厚的胃壁边缘呈网状或不规则形，或者病变处的胃周脂肪组织模糊；T。或T4：胃癌组织和邻近脏器问的脂肪层消失；T。：邻近脏器的浸润。胃癌T分期是影响切除率的主要因素，胃癌CT的最大价值是术前判定能否手术切除肿瘤，减少不必要开腹手术的发生。CT在胃癌分期诊断中尚存在一定的局限性，对早期胃癌的检出率低，_一般仅为40％，尤其是小的溃疡型早癌Ⅲ1。CT分期还存在过高和过低现象。分期过低主要是由于正常大小的淋巴结已发生转移或胰腺、肝内、腹膜的小转移灶不能检出。分期 青岛大学硕士学位论文过高主要是癌肿尚未穿透胃壁全层，但其周围脂肪层消失；溃疡型胃癌时溃疡底部凹凸不平，且有腐烂组织及出血凝块附于溃疡壁，致堤壁角测量有误‘一1。此外，有时候胃部CT将反应性增生及炎性淋巴结误认为转移灶。C，r在胃癌诊断中也有漏检的问题，主要原因有扫描层较厚而病灶较小或多病灶时仅发现1个病灶而忽视另1个病灶。此外潴留液及患者的呼吸运动也可影响CT诊断的准确性。3内镜检查目前内镜检查是发现早期胃癌最有效的方法。临床上常用的内镜主要有电子纤维胃镜和超声内镜。电子纤维胃镜可贴近胃黏膜表面观察，发现黏膜细微改变。根据日本科学家的观察研究，提高早期胃癌诊断率的重要环节是发现早期胃癌的特征和细微变化，宜将早期胃癌分为3型：I型隆起型，II型浅表型，Ⅲ型凹陷型。内镜下的主要表现为粘膜粗糙感、处之易出血、斑片状充血及粘膜糜烂。隆起型早期胃癌表面不平，可发红或稍带苍白，表现可有出血、糜烂及白苔附着。浅表型早期胃癌黏膜褪色，失去原有光泽。凹陷型早期胃癌，应注意凹陷周围黏膜皱襞的变化，例如呈阶梯状凹陷、皱襞末端变色或虫咬状中断。内镜下鉴别良恶性溃疡至关重要，首先是肉眼下形态的辨识，下列指征对良恶性溃疡有重要鉴别意义：(1)黏膜皱襞良性溃疡达口，恶性中断；(2)溃疡边缘污斑是恶性溃疡征象；(3)阶梯状凹陷是恶性的特征嘲。胃镜的肉眼观察结合其他辅助检查，胃癌的诊断正确率可达97．4％幽】。内镜诊断靠肉眼观察病变，因此凡是能影响肉眼观察的因素就可以导致漏诊，如表面污物覆盖，医师经验水平等，再者由于个体差异以及病变本身的动态变化等因素的影响，对病变早期的判断也有一定难度。电子纤维胃镜检查的盲点是对胃壁外侵犯、淋巴结转移、远隔脏器转移无法判定。超声内镜是将超声波和内镜结合起来的一种检查方法，具备内镜和超声的双重功能。将超声探头导入胃腔贴近病灶进行扫描，既可直视胃黏膜病变，又可清晰观察病灶的浸润深度以及探查胃周围淋巴结和附近脏器转移情况，为早期胃癌的确诊和治疗前TNM分期而选择合理的治疗方式提供依据。超声内镜下，正常胃黏膜分为黏膜层、粘膜肌层、黏膜下层、固有肌层、浆膜层5层，分别显示为高回声、低回声、高回声、低回声、高回声5层清晰结构，黏膜肌层的显像对早期胃癌浸润深度的判断尤为重要。层次结构的改变是超声内镜下T分期的依据。在检查隆起型黏膜早期胃癌时，除隆起性病变外，可发现第1层和第2层结构紊乱，第3层仍保持完整和连续性的表现。．检查黏膜下早期胃癌时，可见肿瘤浸润引起的第3层不规则和狭窄，但无中断现象。鉴别早期胃癌和进展期胃癌的准确率可达90％，判断癌肿对各层累及的正确率可达70％-80％啪1。近10年来超声内镜引导下细针穿刺及活检可获组织进行病理学检查，对胃癌病理活检准确率达94％口¨，对胃癌侵犯深度判断准确率为81％，淋巴结 综述转移准确率为73％。但超声内镜检查越有11％的病例因肿瘤周围炎症而发生分级偏高，又因未发现癌的微小侵润或侵润较深而分级偏低者越占4％。淋巴结转移检出率也有一定得局限性瞄羽。．有研究认为：恶性溃疡可以反复形成、愈合，具有愈合一溃疡一再愈合一再溃疡的特点，若内镜检查时正遇上溃疡愈合期，则观察到的仅是基本正常的胃黏膜或趋于良性溃疡的形态。内镜表现也容易与其他疾病混淆，胃癌发生出血、梗阻、穿孔等并发症，常被草率地误认为消化性溃疡。临床循证医学研究证明，内镜检查联合多种辅助检查，早期胃癌的检出率仍低于20％，检出的大多数患者为进展期胃癌或己发生远处转移的晚期胃癌。内镜检查费用高、耗时长，不适合我国大面积的普查筛选，同时检查时也给病人带来诸多不适，急切需要发展一种新技术，便于早期胃癌的诊断。目前，分子生物学技术的发展及蛋白质组学的研究为早期胃癌诊断闪出了一道亮光，是最有希望早期检测肿瘤方法．，为肿瘤的研究提供了新的思维模式。4血清学肿瘤标志物检测．胃癌被认为是一种多基因，多步骤的复杂性疾病，其发生发展是多个基因突变的过程。针对这一疾病，除了寻找新的治疗手段，更重要的是提高早期胃癌的诊断水平。目前胃癌的诊断主要依靠X线、CT、内镜及病理学检查，这些检查手段具有侵入性，给患者身心带来一定得损伤。为寻求简便、快捷、无损伤、无痛苦的检查方法，人们开始在胃癌患者外周血检测中寻找与胃癌相关的肿瘤标志物，以期能够进行早期胃癌诊断。最近大量研究表明，单个肿瘤标志物尚不足用于早期肿瘤的诊断，有不少学者利用多个肿瘤标志物组成一个蛋白质组诊断模型进行全身多个系统肿瘤的诊断，比如已经在肝癌‘3洲1、卵巢癌陋驯、乳腺癌‘4‘H41、肺癌H渊1、前列腺癌‘撕刳、膀胱癌隋渊3、胰腺癌嘀钉、食管癌汹1、大肠癌㈣等疾病的比较蛋白质组学研究中发现了多种疾病相关的蛋白标志物。近年来，学者将重点集中于血清学检测，即肿瘤相关分子标志物的检测。肿瘤标志物是指由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身，或分泌至血液或其他体液，或因肿瘤组织刺激，由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质，大多数为蛋白质类物质。从理论上说，任何疾病在出现病理改变之前，其细胞、组织和体液中的蛋白质成分及数量都会有相应改变。人血清是一个相当丰富并不断变化的蛋白质系统，单一分子标记物难以追溯到相关的细胞、组织，而发现一组与特定细胞、组织癌变相关的血清蛋白质并对其进行研究有可能直接获取疾病相关的特征性分子标志物。以蛋白质组成成分为研究对象的蛋白质组学的方法为肿瘤的研究提供了新 青岛大学硕士学位论文的思维模式。研究表明，血清、尿液等体液中含有大量疾病标志物，而且血液中可能含有大量未发现的可用作疾病标志物的多肽呻3。目前肿瘤标志物常用的检测技术有免疫学检测技术、分子生物学检测技术及蛋白指纹图谱技术。免疫学检测技术和分子生物学检测技术比较成熟，已经研究出多种胃癌相关的肿瘤标志物，如CEA、CA724、CAl9—9、CA50、AFP、CA242、B2一MG、胃癌抗原、组织多肽抗等已经广泛用于临床‘躺¨。单一肿瘤标志物特异性、敏感度均低，不能满足胃癌的早期诊断、鉴别诊断、疗效及预后评估在临床应用的要求，而联合检测多种肿瘤相关标志物能明显提高早期胃癌的检出率。．、蛋白指纹图谱技术最早是由许洋博士于本世纪初在中国提出，并于2004年8月在《亚太地区国际肿瘤生物学和医学暨第21届国际肿瘤标志物学术会议》和2005年4月《美国第96届肿瘤年会》上正式报道蛋白指纹图谱技术在中国的应用。该技提出后在中国医学界迅速引起巨大的反响。据美国权威杂志《癌症研究》报道，10—15年时间一个癌细胞可以长成癌，蛋白指纹图谱技术可以检测出前列腺癌形成3—5年前的蛋白图谱。因此早期发现、早期诊断肿瘤在理论上完全可能的，这为癌症病人的早期诊断、有效治疗乃至彻底治疗闪出了一道亮光。蛋白指纹图谱技术的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后形成荷电离子，不同质荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案。将所检测人的蛋白质图谱与正常人标准图谱相对照，分析有无差异，就知道这个人的图谱是是否患有某种疾病，或是存有某一种或一组尚未探明的新的特异性分子标志物。几十分钟或几分钟就可以完成整个质谱的测定过程，十分迅速，方法敏感、特异性高，同时一般不会破坏所测定的蛋白质化学结构。该技术通过对蛋白质动态、全程的分析观察，对疾病早期微小变化进行探索，将病人全套血清蛋白质变化记录下来；绘制成蛋白指纹图谱就可以显示所测样品中各种蛋白质不同信息，并将这张图谱标准图谱进行对照，就能发现捕获到与疾病相关的、新的、敏感性特异性高的血清蛋白质及特征。近几年，新兴的表面增强激光解吸电离一飞行时间质谱(surfaceenhanced1aserdesorption／ionization—timeofflight—massspectrometrytechnology，SELDI—TOF—MS)技术为差异蛋白质组学研究提供了一个十分理想的平台，同时也为全身多个系统肿瘤标志物的研究提供了一个理想的平台。SELDI—TOF—MS技术是由日本著名科学家田中耕一发明，美国CiphergenBiosyetems公司进行进一步研究并使之商品化。该系统由3部分组成：①蛋白质芯片；②芯片阅读器⑧生物信息学。该技术的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后形成荷电离子，不同质 综述荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案，可以显示不同蛋白的相对分子量等信息。SELDI技术能快速分析、处理大量质谱图信息，将测得质谱图与正常人或某种疾病或者疾病不同阶段的标准图谱进行对比，就能捕获该疾病不同阶段特异性的相关分子蛋白质。表面加强解吸电离一飞行时间质谱(SELDI—TOF—MS)技术不同与传统的蛋白质组学技术，有以下一些优点：(1)1次可以实现上万种蛋白质检测分析，快速、简便、易行、高通量、平行分析，；(2)需样品量极少，只需25,---'50个细胞所提取的蛋白质即可；(3)较高的信噪比；(4)可以对小分子量的蛋白质进行鉴定：(5)可以和基因芯片结果进行比较分析，在蛋白质组和基因组之间建立联系；(6)应用多个未明确性质的蛋白质或肽信号可联合组成诊断模型，对全身各系统肿瘤的早期诊断比单一的肿瘤标志物更准确可靠，敏感性特异度更高等。SELDI—TOE-MS技术克服了诸多传统蛋白质组学研究中无法解决的问题，实现了蛋白质芯片技术临床检测应用的飞跃。高通量的质谱技术为寻找新的标志物用于早期肿瘤的诊断和监测治疗效果，已经成为一个临床医学研究的新方向。Su等∞刃运用SELDl-TOF-MS技术对127例胃癌患者和100例健康对照组、9例良性胃疾病对照组、9例结肠癌对照组的血清样本进行检测，捕获3个有显著差别意义的蛋白波峰，质荷比分别是1468、3935和7560m／z，3个蛋白波峰可组合成诊断胃癌蛋白租模型，对胃癌和非胃癌患者血清样本盲法分析预测，胃癌诊断的敏感性为85．3％特异性88．O％，准确性为86．4％。Qian等阳1用SELDI-TOF—MS技术分析了30例胃癌和30例非胃癌血清样本，发现16个波峰有明显统计学差异，其中9个蛋白峰在胃癌患者中高表达，质荷比为7567和5252m／z的蛋白峰可以建立胃癌诊断的质谱模型，然后用来检测其余70例血清样本，敏感性90％，特异性86．7％，准确性88．6％。Liang等删用SELDI-TOF-MS技术检测胃癌患者、胃炎患者和健康志愿者血清蛋白谱，发现质荷比为5910、5084和8691m／z的蛋白峰有明显差异，用这3个标记物建立胃癌诊断的蛋白质谱模型，进行双盲检测胃癌与健康人血清样本，阳性预测值93．3％，阴性预测值100％；检测胃癌与胃炎血清样本，阳性预测值93．9％，阴性预测值90．9％。以上实验结果均优于目前临床上经常使用的胃癌相关的血清标记物，如CEA、CAl99、CAl25和CA724等。表面加强解吸电离．飞行时间质谱(SELDI．TOF．MS)技术在早期胃癌诊断的差异蛋白质组学研究中，虽然优于传统的蛋白质分析技术，但在临床实际运用中仍面临严峻挑战，其不足如下：不能对所检测的蛋白质直接进行鉴定，对蛋白质性质、空间结构、功能等研究仍需要依赖传统的蛋白鉴定技术，如激光解析离子化质谱仪、生物信息学、二维电泳、基质辅助等。质谱信息的分析处理及分子生物信息学的广泛应用还有待进一步研究，芯片制各质量均一性、质控方面及实验重复性评价等问题的研究还有待完善。随着芯片技术、质谱分析技术及蛋白质分离 青岛大学硕士学位论文纯化技术的发展，以及在研究方法上新的突破和分子生物信息学工具的不断完善，在更高水平上寻找新的肿瘤相关功能蛋白组和标记物成为可能，从而在肿瘤发生机制、诊断、分期和治疗效果检测中取得重大突破，同时也为探寻新的诊断方法和治疗靶标提供有力依据，也为胃癌的研究、早期诊断和早期治疗带来新的曙光。通过差异蛋白质组学的研究，寻找和确立一组早期肿瘤相关的蛋白质特异性分子标志物．这些分子标志物将有可能成为发现早期肿瘤的“利器”。5面临的问题与展望采用回顾性及前瞻性队列研究，立足于整体角度，对目前报道的肿瘤标志物在主要人肿瘤中以单一或新的组合形式进行大规模验证，筛选，进一步采用血清蛋白质组的方法试图寻找新的肿瘤标记。建立以血清蛋白标记为主的人恶性肿瘤早期诊断，分子分期指标体系与相关标准，国内外未见类似大规模的研究报道。使用SELDL-TOF-MS研究人恶性肿瘤血清特异蛋白标记，系统筛选相关标记物及其组合，将可以提高诊断的准确性。有可能发现更加精确和可重复的诊断方法，从而筛选出用于人恶性肿瘤早期诊断的方案。对这些分子的纯化、鉴定等深入分析可以更深入地了解肿瘤发病机理，同时为药物、生物治疗肿瘤提供重要的耙点选择和理论支持。近年来，各国著名科学家包括不少诺贝尔获奖者，对肿瘤在分子生物学方面的行为、特征进行了大量的研究探索，取得了多项非常有价值的研究成果，但这些研究成果在降低肿瘤发生、降低肿瘤引起死亡等方面效果不显著。美国肿瘤学界曾经公布一项权威性的比较研究，显示自上世纪70年代以来，虽然不断有新的早期肿瘤诊断和检测治疗效果的方法问世，但是全世界早期肿瘤诊断率及肿瘤致死率并没有显著改善。通过蛋白质组学研究来寻找和确立一批肿瘤蛋白的特异性分子标志物，这些分子标志物将有可能成为早期发现肿瘤的“利器"。31 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