atngb融合蛋白的原核表达及其对小鼠脑缺血影响的分析

《atngb融合蛋白的原核表达及其对小鼠脑缺血影响的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、福建医科大学博士学位论文TAT-Ngb融合蛋白的原核表达及其对小鼠脑缺血影响的研究摘要背景与目的脑血管病是危害极大的常见病、多发病，目前缺乏切实有效的脑保护剂。脑红蛋白(Neuroglobin，Ngb)是本世纪新发现的第三种携氧球蛋白，能与氧可逆性结合，主要存在于脑内。已有研究表明Ngb可减轻神经元及脑组织的缺血缺氧性损伤，因此有望成为新型脑保护剂。然而，Ngb是一个大分子蛋白，无法透过细胞膜，更无法透过血脑屏障(blood．brainbarrier，BBB)到达脑内，限制了它在临床的直接应用。吖盯蛋白转导结构域(pro

2、teintransductiondomain，PTD)能携带大分子蛋白从血液中迅速透过BBB进入脑内。利用TAT蛋白转导技术，将可能解决Ngb自身无法透过BBB进入脑内细胞发挥脑保护作用的瓶颈问题。目前，已有离体研究表明原核表达的TAT-Ngb融合蛋白(简称TAT-Ngb)能转导原代培养的大鼠皮质神经元和人的胰岛细胞并发挥抗缺氧损伤作用‘13，2引。但迄今为止，国内外尚未见有动物在体验证TAT-Ngb透过BBB功能进入脑内并发挥脑保护作用的研究报道。本研究拟通过原核表达方法制备融合蛋白TAT-Ngb，联合WesternB

3、lot及免疫荧光染色验证TAT-Ngb穿透小鼠BBB的功能，并用TAT-Ngb治疗小鼠大脑中动脉阻塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型，观察TAT-Ngb在局灶性脑缺血中的脑保护作用，探讨其可能的保护机制，为脑血管病的神经保护治疗提供新的方向和思路。方法1．构建pET28b．TAT-Ngb及pET28b-Ngb原核表达质粒，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达TAT-Ngb及Ngb融合蛋白，表达产物通过SDS．PAGE进行蛋白表达高峰及可溶性分析，并行WesternBlot

4、鉴定，Ni．NTAResin亲和层析柱纯化蛋白，PD．10脱盐柱进行蛋白脱盐。福建医科大学博jI：学位论文2．将TAT-Ngb或Ngb尾静脉注射近交系C57BL／6J小鼠，l或4h后处死小鼠取脑，以Ngb单克隆抗体为一抗，WesternBlot、免疫荧光染色对注射TAT-Ngb后的小鼠脑组织分别进行Ngb蛋白定量、定位检测，验证TAT-Ngb穿透小鼠BBB的功能。3．采用线栓法制备小鼠的MCAO局灶性脑缺血．再灌注模型，缺血时间为30min或2h。模型制备中采用以下措施以使模型稳定：面罩吸入异氟烷麻醉；监测并维持平均动脉

5、血压、血气指标、体温在正常范围；术中还通过脑血流仪监测来判断血流下降程度，使脑缺血程度基本一致。再灌注24h或72h后进行神经功能缺损评分，处死动物并制备脑组织石蜡切片，分别行HE染色、尼氏染色和TUNEL染色。4．MCAO缺血2h再灌注24h组分四个亚组，分别于MCAO前2h静脉注射生理盐水、Ngb或TAT-Ngb进行预先干预，或缺血2h时(再灌注即刻)静脉注射TAT-Ngb治疗。再灌注24h后进行神经功能缺损评分，处死动物并取脑进行，丌C染色，测量并计算出脑梗死体积。5．MCAO缺血30min再灌注72h组分三个亚组

6、，于MCAO缺血30min时(再灌注即刻)分别静脉注射生理盐水、Ngb或TAT-Ngb治疗。再灌注72h后进行神经功能缺损评分，处死动物并制备脑组织石蜡切片，使用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(Terminaldeoxynucleotidyltransferase．mediateddUTPnickend．1abeling，TUNEL)染色检测细胞凋亡，使用焦油紫进行尼氏染色，在每张脑组织切片的纹状体区观察6个高倍视野并计数，计数每高倍视野的TUNEL阳性细胞，同样方法在尼氏染色切片中计数存活神经元和坏死神经元，神经元存活率

7、=存活神经元／(存活神经元+坏死神经元)。结果1．成功构建pET28b—TAT-Ngb及pET28b-Ngb原核表达质粒并诱导蛋白表达，经纯化、脱盐后获得高产量的TAT-Ngb及Ngb融合蛋白。2．WesternBlot检测表明TAT-Ngb注射4h后进入了脑内；而Ngb注射4h后未能进入脑内。免疫荧光检测发现TAT-Ngb注射lh后进入了脑内毛4福建医科人学博士学位论文细血管壁，4h后进入了脑组织神经元，在细胞浆弥散表达；而Ngb注射4h后未能进入了脑组织。3．采用线栓法成功建立了稳定的小鼠MCAO再灌注模型。缺血2h

8、组和30min组小鼠神经功能缺损评分分别为2．67+0．82和O分；2hMCAO脑缺血导致皮质纹状体梗死，而30minMCAO脑缺血导致局限于纹状体的选择性神经元损伤。4．在MCAO缺血2h再灌注24h组，与生理盐水组相比，缺血前应用TAT-Ngb能明显减少梗死体积和神经功能缺损评分(p<0．01)；而且在缺血2h后