gf-β,1smads信号转导途径在肺肌成纤维细胞分化中的作用及ifn-γ 地塞米松的影响

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1、一!璺塑塑垦型查兰堡圭堂垡兰苎中文摘要一、Smads蛋白在TGF．B1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中作用目的：肺肌成纤维细胞在肺纤维化发生机制中起重要作用，其分化标志是a一平滑肌肌动蛋白(Q—smoothmuscleactin，a—SMA)的表达。研究发现TGF-且．可通过Smads蛋白家族成员传递信号发挥生物作用，因此本研究主要探讨在TGF一13，诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中，各Smad蛋白对d—SMA基因表达的调控作用。方法：1、体外培养人胚胎肺成纤维细胞(HFL—F)，TGF—B。干预后通过Weste

2、rnblot及RT—PCR分析a—SMA基因mRNA和蛋白水平表达的变化，同时用免疫荧光法观察细胞形态改变。2、构建含人d—SMA基因启动子序列的荧光素酶报告基因质粒(p895-Luc)和Smad2突变表达质粒(pSmad2“‘)：以人基因组DNA为模板用PCR扩增人a-SMA基因启动子一895～+9bp序列，插入到pGal3一basic质粒的MluI和XhoI酶切位点之间形成p895一Luc。突变Smad2序列是通过以pCS。一Smad2质粒为模板用PCR方法获取，然后将其插入到经占鲰II和XhoI酶切后的pCS。一Smad2

3、质粒片段形成pCS：一Smad2“。Smad2、Smad3、Smad7和Smad3“表达质粒为他人惠赠。3、用Fugene6．0将p895一Luc分别和各种Smad表达质粒瞬时共转染至HFL—F中，TGF一0，干预后测定其荧光素酶和B·半乳糖苷酶的活性。4、用Fugene6．0将各种Smad表达质粒瞬时转染至HFL—F中，TGF一0．干预后通过Westernblot分析a—SMA基因的蛋白表达。结果：1、5ng／mlTGF—B。作用4天能诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。2、过表达Smad3／毙增强TGF一131诱导的a—Sg

4、A基因启动子活性和其蛋白表达，而过表达smad3能抑制这种增强作用，但没有使其恢复到基础水平，两者对a～SMA基因的基础表达没有影响。3、过表达Smad2和Smad2mu‘不影响TGF—B。对q—SMA基因启动予活性及蛋白表达的!里堡塑堕型查兰塑主堂垡丝兰调节，对a—sMA基因的基础表达也没有影响。4、过表达Smad7可抑制TGF—Bl对a-SMA基因启动子活性和蛋白表达的增强作用，但没有使其恢复到基础水平，对a—sMA基因的基础表达也没有影响。结论：在TGF。Bl诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中，分化标志a—SMA基因

5、的表达主要受Smad3正调控，在此过程中Smad7起负调控作用，而Smad2对此过程无影响。关键词：成纤维细胞；肌成纤维细胞；转化生长因子．B，；Q一平滑肌肌动蛋白；Smads蛋白二、Smad3对博莱霉素诱导肺维化模型中肌成纤维细胞分化的作用目的：我们体外研究发现在TGF—B，诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中，主要由Smad3诱导a—SMA基因的表达。但体内肺损伤纤维化过程中肌成纤维细胞分化的机制还不清楚。因此我们选用Smad3基因野生型(Smad3WT)和Smad3基因敲除型(Smad3KO)小鼠制作博莱霉素(bleo

6、mycin，BL)诱导的肺纤维化模型，探讨体内肺纤维化过程中Smad3对肌成纤维细胞分化所起的作用。方法：1、皮下植入含博莱霉素微型泵来制作博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。2、HE染色检测组织学改变，Masson染色观察胶原沉积分布情况，用Q—SMA抗体进行特异免疫组织化学法染色以了解肌成纤维细胞在肺组织中的分布特征。3、肺组织羟脯氨酸含量的定量分析。4、Westernblot定量分析肺组织中Ⅱ一SMA的表达。结果：l、Smad3WT—BL28小鼠肺组织镜下表现为肺泡结构的破坏主要分布在胸膜下，而气管、支气管周围受累较少。肺损伤

7、处有炎性细胞浸润、胶原沉积和大量表达d—SMA的肌成纤维细胞出现。而Smad3KO-BL28小鼠肺泡结构的破坏、胶原沉积的范围和肌成纤维细胞的数目都明显减少。定量研究也显示Smad3KO—BL±8小鼠肺组织羟脯氨酸含量和d—SMA蛋白表达量均比Smad3WT—BL28小鼠显著减少(两者均为P<0．05)。2、Smad3WT—BL，和Smad3KO—BL7小鼠肺组织的改变相似，主要为炎性细胞浸润，中国协和医科大学博士学位论文胶原沉积和肌成纤维细胞的数目都很少。结论：TGF—B-／Smad3信号转导途径在博莱霉素诱导小鼠肺纤维化过程

8、中对肌成纤维细胞的分化起重要调节作用。关键词：博莱霉素；肺纤维化；Smad3：TGF—B。三、干扰素一Y、地塞米松对TGF—B。诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响目的：研究干扰素一Y、地塞米松对TGF一0，诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响及可能机