masp-2在肺癌患者血清中的表达及临床意义

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河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河=II-i医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。、，i二。。。一’：hj、‘‘0t二。‘t．j“'，‘-r‘‘_．Ⅵ砬磐《·篓，掣研究生签名：习微导师签章密饬碰}、、二级学院领导盖章：蘑黎蒜l卫刃f年6月?D日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：刁徽导师签章．喜卜昶惫．导师签章：袭卜椒夺’旦参}妄年琴其3pB万方数据 ⅢIlllllllllllllllllllilllllllllllllllllll删目录Y2784412中文摘要1英文摘要·”4英文缩写·8研究论文MASP．2在肺癌患者血清中的表达及临床意义前言刖舌。-9材料与方法“10结果15附图．．17附表·23讨论27结j念·30参考文献．．31综述MASP．2的研究进展．．35致谢．．50个人简历一51万方数据 中文摘要MASP-2在肺癌患者血清中的表达及临床意义摘要目的：肺癌，又称支气管肺癌，现已成为我国发病率增长最快，致死率居首的恶性肿瘤，发病原因及机制尚不十分清楚。l晦床常见的患者多为肺癌晚期，又常常合并肺部感染，预后较差。因此，人们不断研究新的方法，以便肺癌的早期检查和治疗。MASP．2是补体系统凝集素激活途径的关键酶，活化的MASP．2先后裂解C4和C2最终形成C3转化酶，从而激活补体发挥杀伤靶细胞作用。MASP．2基因多态性及其血清含量的变化与肿瘤、感染性疾病相关，如：艾滋病病人肺炎球菌菌血症的发生，以及甲状腺肿瘤患者、女性卵巢癌患者均与MASP．2相关，但未进一步分析MASP．2含量与疾病转归的影响。本研究旨在探讨肺癌患者血清MASP．2水平并对MASP．2基因外显子3第105位密码子多态性进行分析，并与肺癌患者的临床资料进行相关性分析，初步探讨MASP．2含量变化及基因突变与肺癌的发生、发展、疗效及预后等的关系。为肺癌的辅助诊断、早期防治、复发与转移的监测、生存率评估等方面，提供有价值的参考依据。方法：l收集病例：收集河北北方学院附属第一医院和中国人民解放军第251医院呼吸科和心胸外科2014年3月．2014年12月住院的63例肺癌患者(肺癌组)，其中初次诊断未治疗患者20例(以下简称肺癌1)。肺部感染患者39例(肺感染组)；健康体检者80例作为对照(对照组)。2分组：收集肺癌患者临床及肿瘤标记物检测资料，并将63例肺癌患者分别按性别(男／女组)、年龄(<60／≥60组)、病程、肿瘤分期(III／HIIVY)、转移(癌转移／未转移组)以及化疗(4L疗／未化疗组)和手术(手术／未手术组)分别进行组内检测对比；另外，肿瘤标记物选取共性的血清铁蛋白(SF)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA．125)三项指标，按其在外周血中的含量将39例肺癌患者各分为升高组和正常组，两两比较MASP．2血清水平的变化。3标本采集：空腹肘正中静脉血2ml。肺癌组和感染组病例于入院当日或转日晨采集，对照组同时采血。万方数据 中文摘要4MASP．2含量检测：所有外周血标本EDTA抗凝，低速离心，分离血清，采用酶联免疫吸附(EUSA)方法检测MASP．2含量，分析MASP一2在肺癌和肺感染患者及健康体检者外周血中表达的差异，并分析肺癌患者血清MASP．2水平与各临床参数及肿瘤标记物检测指标之间的关系。5ASP．2SNP检测：取肺癌患者血细胞，提取DNA，用SSP．PCR法检测肺癌患者MASP．2基因D105G位点突变情况。结果：l20例肺癌初次诊断患者(肺癌1)血清MASP．2含量中位数M为293．91，P25-P75为247．17．406．76ng／ml，健康体检者M为444．55，P25-P75为333．54．580．87ng／ml，肺癌l组低于正常对照组，差异有统计学意义(尸0．05)．TherelationshipbetweentheconcentrationofMASP-2andSFwasanalyzedwithSpearmantestandtherewasapositivecorrelation(r=0．603，尺O．01)．TherelationshipbetweentheconcentrationofMASP··2andCA-·125wasalsoanalyzedwithSpearmantestandtherewasapositivecorrelation(r=0．573，PO．05)(Fig．5，Table3)。3血清MASP．2含量与肿瘤标记物指标相关性分析肺癌患者血清MASP．2含量与CEAl拘spearman秩相关系数为O．201，P值为0．219；与SF的spearman秩相关系数为0．609，p值为0．000；与CA．125血清水平I约spearman秩相关系数为0．573，p值为O．000。(Fi96，Table4)4肺癌患者MASP．2基因D105G位密码子点突变情况的检测(SSP．PCR)对基因突变类型分析，SSP．PCR结果显示63例肺癌患者MASP．2基因D105G位点等位基因126个全部为A(100％)；39例肺感染患者MASP．2基因D105G位点等位基因78个全部为A(100％)；健康对照组MASP．2基因D105G位点等位基因有160个也均为A(100％)，没有发现等位基因G，应用t检验，结果P>0．05。万方数据 研究论文63例肺癌患者，39例肺感染患者和80例健康对照组MASP．2基因密码子D105G位点全部为A／A型野生纯合子，组间比较没有统计学差异pO．05)。(见Fig．7，Table5)。万方数据 研究论文附图羽帅Pleph．ase。。pⅢleas¨th。e。ri。ghtm．。uPIese蚶buttlfoonf|heorthlp_eS=0．11828598I=0．98882241292．’o虿、妒。芒丁i、爹‘趸《>--Q妒QpQ妒0．018．336．755．073．391．7I10．0×Axis(units)Fig．1StandardcurveofserumMASP-2byELISAFig．2ThemedianplasmalevelsofMASP-2inpatientswithlungcancer(1)andpulmonaryinfectionandnormalgroup(氏0．05)17万方数据 研究论文J4uu戮藤蒸黼纛鬻鬻豢豢黧麟i1200鬻麟麟麟麓鬻熏豢黧鬻鬻-三；1000皇：黧鬻蘸鬻慧黧鬻鬻冀蒸鬻夔攀嗣：磁髓彗≥鬻麓誊蓑：§纛簿j鬻㈣荔纂：露g800曩鲁600_鬻一滕鬻一縻鬻一匿麴象至蒸貔飘蕊鬻纂‰蘸鬻熏爨蒸藜i《400200漂蒸蒸纂鬻臻爨蒺豢蘩鬻鬻豢i鬻’1。一7。“。“77。‘。4’’’0。一1ungCancerpulmonaryiIifectionnormalgroupFig．3ThemedianplasmalevelsofMASP-2inpatientswithSungcancerandpulmonaryinfectionandnormalgroup(P>O．05、)o1200翟嚣皇1000■百800墨皇％600置N40。氢乏200UmetastasiswithoutmetastasisaThemedianplasmalevelofMASP-2bThemedianplasmalevelofMASP一2inmaleorfemalepatientspO．05)inpatientawithmetastasisornotransfer衅0．05)18万方数据 研究论文啪咖咖㈣=o一_真．I-=∞u皇oo嚣—皇舶霸一【I枷瑚N．tI∽—、_^Iochemotherapxgroup“ithoutchemotherap、groupCThemedianplasmalevelofdThemedianplasmalevelofMASP一2inpatientswithchemotherapyMASP一2inpatientsindifferentornochemotherapy(P<0．05)TNMstaging(尸<0．05)耋60<60eThemedianplasmalevelofMASP-2fThemedianplasmalevelofMASP一2inpatientswithsurgeryorwithoutinvariousagegroups(PO．05)Fig．4TherelationshipsbetweentheclinicalparametersandMASP-2expression19万方数据 研究论文aThemedianplasmalevelofMASP-2inpatientswithdifferentserumCEAlevel(尸>0．05)bThemedianplasmalevelofMASP一2inpatientswithdifferentserumSFlevel(P<0．05)CThemedianplasmalevelofMASP一2inpatientswithdifferentserumCA-125level畎0．05)Fig．5TherelationshipsbetweenthetumormarkersandserumMASP．2concentration20万方数据 研究论文MASP-2andSFaThescatterdiagramofthe3000●relationshipbetweenSFand2500y=0．6747x+83．963●R2=0．1062MASP．2serumconcentration．2000r=0．609P=O．0001500】000500O14(10MASP-2andCA一1252500diagramofthebThescatter●relationshipbetweenCA-125and200()●MASP一2serumconcentration．15o(}r=0．573P=D．000J()0()吵幺_一≤■一0200400600800100012001400-500MASP-2andCEACThescatterdiagramofthe●relationshipbetweenCEAand500●MASP-2serumconcentration40()y=0．057x+5．7867R2=0．0182r=0．209P=D．21930020()()dr‰i下_了_：蔓f(}2004006()o80010(XJ1200Fig．6ThespearmanrankcorrelationtestresultsofMASP-2serumlevelsandtumormarkers21万方数据 研究论文l—l1-22-12-23-13-2奎14-2^I2000bp1000bp750bp500bp250bp178bp100bpFig．7TheD105GMASP-2genemutationinpartofresearchobjectsM：2000bpDNAMarker；1-4WildHomozygous万方数据 研究论文附表Table1TheconcentrationofMASP一2inserumoflungcancer(1)Lungcancer,pulmonaryinfectionandcontrolTable2TherelationshipbetweentheclinicalparametersandMASP-2ClinicalparametersNumberMASP-2啦!：里!!!里趔!expressionAge<6028触。5。≥6035溉76．57(282．．05．-480．．2．81(388．．24672．148；‘SexFemale415．．52(293．．04-613-598．48．1748082(395756{眺05Male5211．-13．481．ChemotheraphyNo22Yes296．．87(256．．81-．412．．26480．32(392．0070601{PO．05)。尽管MASP．2缺乏从理论上会造成天然的免疫缺陷，但是导致的临床表现还是有争议的，有研究发现补体的凝集素途径缺乏不会增加铜绿假单胞菌感染性肺炎的发病几率[15】；同样，MASP．2血清含量的降低也与HIV患者肺炎球菌肺炎发生率没有相关性[161。此外，国外有文献报道检测丹麦和巴西南部人群血浆MASP．2含量，认为MASP．2在正常人体血清内浓度为300．600ng／mL，少于200n幽31l为低水平，大于600ng／ml为高水平【21’22。，本实验中检测的正常对照组MASP．2含量均数为448ng／mL左右与文献资料万方数据 研究论文相当，国内外不同的研究组采用的对照MASP．2的值是有差异的。国内尚无有关MASP．2正常血清水平检测的相关报道，一项对甲状腺瘤患者血清MASP．2的表达研究中，测得的对照组均数值y刁203．846ng／mL2铕pJ，考虑原因：一是人群种族差异；二是不同的实验室采用的试剂及制备过程有乏芒升。量尽-肺癌患者血清MASP．2的ELISA结果显示，初次诊断、未进行治疗的20例患者血清的MASP．2水平是降低的，但是MASP．2的含量又与临床资料和病程进展密切相关，越到晚期，尤其转移者，其含量会越高，呈较明显的正性相关(尺O．01)。表明MASP．2参与了肺癌的发生发展过程。MASP．2水平与多种肿瘤具有相关性，首先YttingH等发现高血清MASP．2水平与结直肠癌的高复发率和低生存率相关【7】；在一项有关儿童恶性肿瘤与MASP．2血清水平的研究中发现，急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和中枢神经系统肿瘤患者血清MASP．2水平均升高[17]o国内有一项研究也发现甲状腺乳头状瘤中血清MASP．2水平也升高【l81。但是Tulio等发现HCV患者基因突变导致MASP．2血清水平降低从而增加肝癌的发生风险【191。由此可见MASP．2虽然与肿瘤有相关性，但是在不同肿瘤患者中的表达存在差异，其具体机制也有待进一步研究。我们的研究结果显示MASP．2在肺癌初次诊断未治疗患者血清中低表达，但在病程进展中发生变化，晚期则高表达。首先，我们通过临床资料和肿瘤标记物检测结果分析，(比如20例初次诊断患者中17例未发生器官的转移，其临床分期18例为I～II期)，总体上可以把这20例患者看做肺癌的相对早期组；另外有可能是患者样本量较小，存在一定的偏差，再一方面也可能是因为免疫与肿瘤相互作用的结果。免疫机制在肿瘤发生、发展过程中起着重要作用，反过来肿瘤又能通过抑制或激活免疫功能影响免疫机制，虽然机体有着各种抗肿瘤免疫效应，肿瘤仍会在体内发生、发展，并随着肿瘤的发展，反过来影响机体的免疫状态，降低免疫力[201，即：免疫功能一方面影响肿瘤的发展，肿瘤从另一方面改变免疫功能状态，在肺癌的早期可能由于免疫抑制，MASP．2呈现低表达，在疾病的发展过程中，由于肿瘤的增大、转移激活了体内的某些免疫机制，引起MASP．2高表达。2MASP．2血清含量在不同临床参数组间的差异对肺癌患者血清MASP．2水平与其临床参数进行相关性分析发现：万方数据 研究论文MASP．2血清含量与肺癌的TNM分期、转移、是否化疗及年龄有关(尺O．05)，与手术与否和患者性别没有关系(pO．05)。说明MASP．2的血清水平与肺癌的发展程度密切相关。尽管肺癌患者以男性居多，但是我们的研究却没有发现MASP．2的表达与性别有关；分析结果显示手术后患者的MASP．2水平与未手术组比较并无明显改变，化疗患者的MASP．2总体水平与未化疗者相比呈现升高趋势，这与肺癌的临床治疗效果观察是一致的即：现阶段手术、化疗、放疗等肺癌治疗方法效果并不乐观的现实，患者的生存率仍然很低，当然，由于肺癌的类型、大小、分化程度等的不同，采用的治疗手段及效果也不相同，MASP．2在不同肺癌患者中的表达及其具体机制还有待进一步深入研究。3MASP．2血清含量与肿瘤标记物检测结果的关系肿瘤标记物是一类通过化验尿液、血液或肿瘤组织查出、并反映体内肿瘤情况的物质，在临床上，己被广泛应用于肿瘤的诊断、疗效评估、复发监测和预后推测等。应用于肺癌辅助检查的肿瘤标记物有CEA、CAl25、SF、NSE、SCC等多种[10．11】，分析MASP．2血清水平与肿瘤标记物的相关性，有助于探索鉴别诊断及评价治疗肺癌的新的生物化学标志物。由于肺癌有鳞癌、腺癌、小细胞肺癌等不同类型，其对应的检测肿瘤标记物也存在差异，所以我们选取了大部分医院均测的共同的三项肿瘤标记物CEA、SF、和CA．125作为分析项目。研究结果显示肺癌患者血清MASP．2含量与SF和CA．125的血清水平均呈正性相关，P<0．0001。已知SF和CA．125作为分别监测肺癌转移和临床分期进展的参考指标，这提示着MAS．2水平的升高意味着肺癌病变程度的加重，此次的研究结果也和临床参数的分析结果一致，MASP．2在肺癌转移者和IIIⅣ期患者血清中显著高表达。因此本研究认为血清MASP．2水平可作为一个有效监测肺癌的潜在标记物，对肺癌病程推断、脏器转移监测、预后等具有一定的临床价值，但MASP．2在肺癌发病中是否是一个独立的预后影响因素以及它的具体作用机制还需要进一步研究明确。4MASP．2基因多态性及意义研究结果显示，MASP．2的基因突变可以影响血清水平的变化，并因此可能导致多种疾病。人类基因组变异以点突变最为常见，MASP．2基因中存在多个突变位点，如D120G、P126L、D371Y、V377A等[23-26]。万方数据 研究论文由于基因突变，MASP．2与MBL的结合受到影响，进而阻碍补体活化的凝集素途径，影响机体免疫功能【27】。MASP．2基因突变伴随高感染风险。有研究发现MASP．2CUBl功能区C端的基因外显子3第105位密码子且PDl05G基因突变，由天冬氨酸(Asp、)变为甘氨酸(Gly)，不仅使MASP．2丧失了与MBL以及ficolin分子结合的能力，同时，血清中MASP．2的表达水平下降，从而引起补体凝集素途径功能丧失，引起机体对病原体的反复感染【6]。比如国外有研究显示MASP．2(D105G)突变导致的血清含量降低与社区获得性肺炎的易感性相判281。本次研究对MASP．2基因密码子D105G突变情况进行检测，结果三组均没有发现该位点的突变，这与文献报道并不完全一致，考虑原因：第一可能我国或者本地区该位点突变率很小，即地区或种族差异，国外的研究发现丹麦人群D105G的突变率较高，其他地区没有报道或相对较少[291，目前国内还没有对该位点突变的相关文献报道。第二是事实如此，Schafranski等po】在对风湿热及慢性风湿性心脏病患者的研究也显示MASP．2基因D105G突变率不高。第三是样本量较小，存在一定偏差。综上所述，虽然国内外研究证实MASP．2在补体的凝集素途径中发挥重要作用，其血清含量的变化及基因突变与多种肿瘤及其他疾病具有相关性，而且这种变化存在种族、地区差异。但是在我国有关MASP．2与疾病相关性的研究还较少，具体的作用机制还需进一步探究。结论1MASP．2在肺癌患者(相对早期)血清中的表达是降低的；随着病情的进展MASP．2的表达发生改变，与肺癌的临床分期和转移密切相关，与化疗和年龄也有相关性，与性别和手术无明显相关。2肺癌患者血清中MASP．2水平还和肿瘤标记物SF及CA．125含量呈正性相关，SF升高MASP．2血清水平升高，CA．125升高，MASP．2也升高，可以尝试将MASP．2检测作为评价肺癌病情进展以及治疗效果的指标之一。3与肺感染和健康对照组相比，肺癌患者MASP．2(D105G)基因突变检测并无显著差别。万方数据 研究论文参考文献lStengaard-PedersenK，ThielS，GadjevaM，eta1．Inheriteddeficiencyofmannan—bindinglectin-associatedserineprotease2[J】．TheNewEnglandjoumalofmedicine，2003，349(6)：554-602Huber-LangM，SarmaJV，ZetouneFS，eta1．GenerationofC5ain也eabsenceofC3：anewcomplementactivationpathway[J]．NatMed，2006，12(6)：682-6873石燕萍，张阁玲，等．甲状腺肿瘤患者血清中MBL和MASP．2的表达及意义．广东医学，2012(2)：229．2304AnnaSS，AgnieszkaS，SamborS，eta1．Marmose-BindingLectin(MBL)andMBL-associatedserineprotease一2(MASP-2)inwomenwithmalignantandbenignovariantumours[J]．CancerImmunology，Immunotherapy，2014，63(11)：1129-11405ZehnderA，FischU，HirtA，eta1．Prognosisinpediatrichematologicmalignanciesisassociatedwithserumconcentrationofmannose—bindinglectin—associatedserineprotease-2(MASP-2)[J]．PediatrBloodCancer，2009，53(1)：53-576Stengaard-PedersenK，ThielS，GadjevaM，eta1．Inheriteddeficiencyofmannan-bindinglectin-associatedserineprotease2[J]．TheNewEnglandjournalofmedicine，2003，349(6)：554-607YttingH，ChristensenIJ，SteffensenR，eta1．Mannan-bindinglectin(MBL)andMBL—associatedserineprotease2(MASP-2)genotypesincolorectalcancer[J]．ScandinavianJournalofImmunology,2011，73(2)：122—78Turner㈣Theroleofmannose—bindinglectininhealthanddisease[J]．JMolImmunol，2003，40(7)：423-4299．JemalA，BrayF'CenterMM，eta1．Globalcancerstatistics[J]．CACancerJclin，2011,61(2)：69-9010RamalingamS，BelaniC．Systemicchemotherapyforadvancednon-smallcelllungcancer：recentadvancesandfuturedirections[J]．Oncologist，2008，13(Suppl1)：5-13万方数据 研究论文11安玉增，姜淑华，张丹，等．CEA、CAl25、CYFRA21．I＼NSE联合检测在肺癌诊断中的临床意义．标记免疫分析与临床，2011，18(2)：117．11912ChuXY,HouXB，SongWA，eta1．DiagnosticvaluesofSCC，CEA，Cyfra21-landNSEforlungcancerinpatientswithsuspiciouspulmonarymasses：asinglecenteranalysis[J]．CancerBiolTher,2011，11(12)：995-100013KimSY，HongY，ChoiCM，eta1．ElevatedserumCA一125levelsinpatientswithnon—tuberculousmycobacteriallungdiseas[J]．Respirology，2010，15(2)：357-36014ⅪeyK，OehrP．UsefulnessofcombinedFDG—PETwithCTortumourmarkersinlungcancerdiagnosis[J]．AnticancerRes，2010，30(5)：1741-174515HanyIK，YoussifMA，KumarR，eta1．AbsenceofthelectinactivationpathwayofcomplementdoesnotincreasesusceptibilitytoPseudomonasaeruginosainfections[J]．Immunobiology，2011,217(2)：272-28016HorcajadaJP，LozanoF，MufiozA，eta1．Polymorphicreceptorsoftheinnateimmunesystem(MBL／MASP-2andTLR2／4)andsusceptibilitytopneumococcalbacteremiainHIV-infectedpatients：acase—controlstudy[J]．CurrentHIVResearch，2009，7(2)：218-2317FischUP，ZehnderA，HirtA，eta1．Mannanbindinglectin(MBL)upgradeandtheMBL—associatedserineprotease-2inchildhoodcancer[J]．SwissMedicalWeekly，2011，141"1319118石燕萍，张阁玲，等．MASP．2在甲状腺肿瘤中的表达及其临床意义．中国现代医药杂志，2010(12)：4．619TulioS，FauczFR，WerneckRI，eta1．MASP2genepolymorphismisassociatedwithsusceptibilitytohepatitisCvirusinfection[J]．Humanimmunology，2011,72(10)：912-520段贵芬，王冀星，张宏，等．甘露糖结合凝集素与肿瘤的关系．河北医药，2009，4(31)：861．86321ZehnderA，FischU，HirtA，eta1．Prognosisinpediatrichematologicmalignanciesisassociatedwithserumconcentrationofmannose．binding32万方数据 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研究论文30RamasawmyR，SpinaGS，FaeKC，eta1．Associationofmannose--bindinglectingenepolymorphismbutnotofmannose··bindingserineprotease2withchronicsevereaorticregurgitationofrheumatiCetiology[J]．ClinVaccineImmunol，2008，15(6)：932—936万方数据 综述综述MASP．2研究现状随着天然免疫研究工作的迅速发展，我们从天然免疫的角度重新看待感染性疾病及其预防和治疗，往往有意想不到的收测l】非常重要的一方面就是，发现了天然机体免疫系统中重要的组成部分即补体激活的凝集素途径，这是感染初期就被活化的补体激活途径，而甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MBL．associatedserineprotease2，MASP．2)是目前发现的唯一的能够直接启动补体级联反应的关键蛋白酶【241。MASP．2是甘露聚糖结合凝集素(MBL)下游的一个蛋白酬5】以酶原的形式存在，它可以结合MBL，或当MBL识别病原体时，MASP．2在裂解丝氨酸蛋白酶区N端的精氨酸．异亮氨酸之间的肽键而发生自激活作用【6】之后，MASP．2继续裂解C2和C4，并最终形成C3转化酶【27】。到目前为止，只在肝脏发现了MASP．2rnRNA的表达，机体其他组织都没有表达MASP．2t7。8】。近年来，越来越多的国内外关于MASP．2的文献报道不断证明MASP．2基因多态性及其血清含量的变化与肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病等密切相关。lMASP．2的分子结构MASP．2在天然免疫中，是不可或缺的关键分子，均为单肽链，以酶原的的形式存在于血清中，由MASP．2基因编码。由非催化区和催化区组成，即(CUBl．EGF．CUB2)和(CCPl．CCP2．SP)两部分，从N端到C端按顺序为：CUB区、EGF区(含Ca2+结合体，参与MBL．MASP结合)、CUB区、2个CCP区和SP区(催化功能区，参与激活补体)【9】。其中CUBl结构域由外显子2和外显子3编码；EGF结构域则被外显子4编码；外显子6和7负责编码CUB2结构域；外显子8．11主要编码2个CCP结构域；【10】其中在骨髓多态形成蛋白(bmpl)及补体成分Clr／Cls、Uegf中发现CUB区(eomplementsubeomponentClr／Cls．1ikedomain)，随即把这几种蛋白的第一个大写字母连在一起为其命名。EGF因为是在表皮生长因子EGF(epidermalgrowthfactor)中被发现，故称为类表皮生长因子区域(epidermalgrowthfactor-likedomain，EGF．1ikedomain)，它和N端的万方数据 综述两个CUB区均是MBL．CLR(甘露糖结合凝集素胶原样区)与MASP．2的结合区，与MBL-MASP形成有关，主要以Ca2+依赖方式与MBL—CLR相互作用。然而，这种相互作用的详细情况还不十分明确，Thielens等】研究认为：CUBl．EGF在作用过程中负责与MBL连接，而CUB2则起到加固作用。CUBl．EGF．CUB2只有与MBL结合后，MASP．2才能被激活，继而活化补体的下游成份。作为补体控制蛋白活性调控区，CCP(complementcontrolprotein)与MASP．2底物识别相关。与SP超家族中其他成员的一级结构相比，SP(serineproteasedomain)为丝氨酸蛋白酶区，是催化功能区，含有所有SP酶活性中心高度保守的His、AsP和Ser等3个氨基酸残基，与MASP．2的丝氨酸蛋白酶活性有关【ll’12]。作为由肝细胞生成的同型二聚体，MASP．2主要在感染急性炎症期产生，具有钙离子依赖性，作用方式为头尾相接。催化区负责与CL．11／ficolin／MBL的胶原样结构域连接【13】。当MBL与病原体结合，补体活化时，MASP．2在第2个CCP区和SP区之间的肽链断裂，形成两条多肽链：重链／A链和轻链／B链，质量分别为52KD和31KD，两条多肽链之间的连接依靠二硫键(C434．C552)的活性形式，与C4结合后把它水解成C4a和C4b，再结合C2，并将C2分解成C2a和C2b，最终C3转化酶，激活补体的下游成份，完成补体凝集素途径的激活(Fig．1)。与Cls中CCP2和SP间的刚性界面相比，MASP．2拥有灵活性更高的连接界面，这或许也能从一方面解释在凝集素途径中一个MASP．2就能行使经典途径中Cls和Clr的共同作用【141。但是有不同的观点与传统的认知相反，即MASP．2在水解蛋白过程中不承担自主发起者的角色，MASP．2激活严格取决于MASP．1，在补体激活途径中，MASP．1更具主动性，它产生60％的C2a和C4b结合而形成C3转化酶(Fig．2)[15】。万方数据 综述圈圃圈免疫复舍物碳永化合物上P一、呤C1qC1，C1C以J1．MASPFicolin-№嗨P|上④上⑧Fig．1ThemainwayofcomplementactivationNewmodeIOIdmodelC回一圃／＼C回◆固?17J●◇＼／C3ConvertaseFig．2Comparisonoftheoldmodelandthenewmodelofthelectin—pathwayactivation．2MASP．2基因多态性人MASP2基因位于1号染色体Ip36．3．p36．2区，包含有12个外显子，长度约为20kb。MASP．2基因在转录时被剪接为无丝氨酸蛋白酶活性37万方数据 综述的Mapl9和具有酶活性的MASP．2两种不同的产物【16，17]。编码MApl9的外显子共5个，有4个是和MASP．2完全一样的，另外一个负责编码EQSL即MApl9末端的4个氨基酸【l81。另外11个外显子分别为：外显子l和部分的外显子2编码一段信号肽序列(由15个氨基酸残基构成)；余下的外显子2和外显子3编码CUBl结构域；外显子4编码EGF结构域；外显子6和7编码CUB2结构域；外显子8～11分别编码2个CCP结构域；外显子12用于编码肽激活区、SP结构域以及C末端MASP．2的mRNA特有的非翻译区。MApl9剪接体由前两个常见非催化结构域和外显子5编码的C末端四个额外氨基酸残基构成(Fig．3)【1引。5，拳≥c：：×：嗣彰≥c瓤颡xjc二蛐=：：二：：二萝；臣固e爹脚19Fig．3ThegeneencodingstructurediagramofMASP-2／MAP190圳目前，有关MASP。2基因多态性的研究日渐增多。首先MASP．2的活性受先天遗传因素的影响，据文献研究，基因的变异可以造成MASP．2基因的缺陷【201。基因突变的MASP．2其血清含量也会发生变化，导致在补体凝集素途径中，由于MASP．2与MBL及ficolin等分子形成复合物的能力改变，阻碍活化进程，抑制机体的固有免疫功能[21-23]。据报道，有一罕见的反复感染以及慢性炎症性疾病病例，由于其MASP．2基因点突变(GACl20GGC)，致使其编码产物CUBl区105位的天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly)，MASP．2与MBL以及ficolin分子的结合丧失，MASP．2的血清含量下降，从而引起补体凝集素途径功能丧失，引起机体对病原体的反复感染[241。有研究认为MASP．2基因rs2273346位点TC基因型和rs6695096位点TC基因型均是肺结核的易感基因型；MASP．2基因rs2273346位点与吸烟均存在正交互作用；MASP．2基因rs6695086位点与万方数据 综述饮茶均存在负交互作用。不吸烟人群中，MASP．2基因rs6695096位点与烹调烟雾暴露均存在正交互作用【251。另有研究发现MASP．2基因结构的多态性与丙型病毒性肝炎、麻风病、查加斯病等多种疾病有相关性[26-28】。如Tulio研究发现D371Y位氨基酸的变化导致MASP．2血清含量降低，增加了丙肝感染性导致肝癌的危险性[281，Isabela等研究发现MASP2基因MAPl9基因型第五外显子异常导致的低水平的MASP．2导致了机体对麻风病尤其是结节型麻风病的易感性增加‘3¨。但WangY等【2∞的研究发现MASP．2基因rsl2711521，rs2261695，rs2273346以及rs7548659位点的多态性与非典(Severeacuterespiratorydiseasesyndrome，SARS)冠状病毒的感染无关。YttingH等【30]发现MASP．2基因P．D105G位点的杂合子突变与结直肠癌以及术后感染无关。3MASP．2血清含量MASP．2不同于MBL，它与MASPl、MASP3、sMAp、MBL等共同存在于MBL．MASPs复合物中。在血清水平含量比较低，绝大多数人群在lug／ml以下，有研究认为MASP．2在正常人体血清内浓度为300．600ng／mL[62]。但是SallenbachS通过对从新生儿、婴儿到青少年、成年人不同年龄组的健康人群中血清MASP．2的水平测定，发现根据年龄分组，血清浓度呈显著差异，儿童明显高于婴儿和成年人，所以在做比对时，应建立各自不同范围的血清MASP。2正常范围【371。近来越来越多的研究显示，血清Mu～SP．2水平在感染性疾病、肿瘤【381、自身免疫性疾病【39】等多种疾病中都存较明显的变化[40,41]。MASP．2血清浓度在疾病的发展进程中起着复杂的影响作用。首先通常情况下，过高或者过低的MASP．2水平都不利于免疫系统的正常运行：一方面，MASP．2缺乏的病人往往会伴随有慢性感染以及慢性炎症性疾病[421，虽然临床症状尚存争议，但是MAPS．2缺乏可能会导致免疫力低下另一方面，过高的MASP．2水平会增加炎性疾病发生的危险【431。其次，MASP．2血清浓度与疾病的发生发展是互为因果，互相影响的。MASP．2血清浓度对不同疾病以及同一疾病不同阶段的影响都不尽相同，且许多疾病的发生发展也会导致MASP．2血清浓度的改变。综上所述，鉴于血清中MBL的含量相对充足，但是MASP．2的血清浓度却十分有限[删，且MASP．2又是已知的唯一一种可以直接启动补体万方数据 综述级联反应的MASP其对补体凝集素途径乃至整个非特异性抗菌免疫都至关重要。由于地域、种族差异，不同人群中MASP。2基因点突变频率、血清水平存在明显差异。对于中国人或各民族MASP．2血清浓度范围及其与相关疾病的关系，当前国内并无较全面的报道。4MASP．2功能活性现已知，在凝集素途径中，MASP．2能够与MBL／纤维胶原素结合成类'[NCl的大分子复合物，在MBL／纤维胶原素通过CRD识别原微生物表面的N．氨基半乳糖或甘露糖基等相应糖结构后，构象发生变化：MASP．2被活化，形成同源二聚体，激活后的MASP．2fir．,裂解C4禾11C2，最终形成C3转化酶，组成补体激活的凝集素途径。因MBL和几种纤维胶原素都通过MASP．2激活凝集素途径，故MASP一2在补体激活的凝集素途径中起着重要作用[32,331。其活性丧失将直接导致凝集素途径功能丧失。MASP．2还参与凝血酶的激活，研究结果证实，机体在发生感染或组织损伤时，伴随炎症反应过程，凝血系统也和补体系统一样被活化，两者协同发展。MASP．2能特异性的通过激活凝血酶原促使凝血酶的产生，从而解凝血因子Ⅷ及纤维蛋白剧34]。C3缺陷时，凝血酶还能够替代C3形成C5转化酶【531。由此可见，MASP．2通过纤凝系统也可以对肉芽肿病的发生发展具有一定程度的影响。GerveraA等通过建立小鼠大脑中动脉闭塞模型，发现在脑缺血再灌注损伤过程中，补体系统激活的凝集素途径发挥重要作用，且不受缺血时间长短的影响【351。此外，PedersnED等通过免疫组化方法，发现MASP．2在缺血管病变脑组织中广泛表达【361。5MASP．2与疾病相关性由于MASP．2在激活补体凝集素途径中而发挥的生物学作用以及MASP．2的基因突变及血清含量的变化，可以引发多种疾病，或者说和多种疾病的发生发展具有相关性[451。尤其近些年越来越多的研究表明，MASP．2与感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病具有关联性，所以在疾病的辅助诊断、监测、预防及治疗过程中，MASP．2的作用已成为大家研究的热点。5．1MASp-2与感染性疾病由于在参与自身免疫的凝集素途径中，MBL和几种纤维胶原素都通过MASP．2激活，且MBL和纤维胶原素有较为广泛的识别谱，所以万方数据 综述MASP．2缺陷人群可发生不同病原体的急慢性的反复感染，甚至认为MASP．2缺陷相对MBL缺陷，对感染性疾病的影响更大【461。在对白血病化疗患儿中发生发热性中性粒细胞减少症的几率和MASp．2的相关性研究中发现低水平的MASP．2可以增加白血病患儿发生发热性中性粒细胞减少的风险，延长住院治疗的天刻47]。但是在对艾滋病人感染肺炎球菌肺炎的研究中并没有证据证明MASP．2的多态性和其发生率的关联性【481。尽管补体的激活在急性胰腺炎发病过程中发挥突出作用，而且MBL水平显著升高，但是MASP．2的改变并不明显【491。MASP．2水平的降低增加了机体对麻风病尤其结节性麻风病的敏感性，所以MASP2基因和血清MASP．2的改变对麻风病的进展及预后有一定的价值[501。除了细菌感染，MASP．2的缺陷也与病毒感染有关，如SolbjorgSagedal等对肾移植受者术后发生巨细胞病毒感染几率的研究中发现，移植前受者血浆中低浓度的MASP．2水平与巨细胞病毒感染有关，而MBL水平却与移植后巨细胞病毒感染并无关裂51】。另有一项针对丙型肝炎病毒(HCV)易感性和MASP2基因多态行相关性的报道，通过对104名HCV感染者的研究，发现D371Y的突变显著高于健康对照组，且基因突变位点位于CUBl区和CCP2区【281。5．2MASP．2与癌症石燕萍等通过对甲状腺肿瘤患者血清MBL和MASP．2水平测定发现甲状腺乳头状癌患者MASP．2和MBL血清水平均高于甲状腺腺瘤患者和健康对照者，意味着MASP．2作为免疫防御因子，有间接或直接参与甲状腺肿瘤的免疫防御过程可能[54】。YttingH等人通过多年对结肠直肠癌(CRC)患者与MASP．2的相关性研究，发现与健康志愿者血清相比，高血清水平的MASP．2和结肠直肠癌患者高复发率和低生存率相关，但是从基因水平还不能解释也无法预测CRC的发生[53]o最新的一项关于MASP．2与女性卵巢癌研究发现，在女性卵巢癌患者中MASP．2的基因表达高于健康对照组，表明MASP．2可能通过补体激活的凝集素途径参与了卵巢癌的疾病过程【551。此外有研究认为高水平的MASP．2血清含量与儿科恶性肿瘤的较长生存率相关，尤其是淋巴瘤患者【561。尽管有关不同肿瘤与MASP．2相关性的研究越来越多，但大多处于起始阶段，且观点不一，这可能与遗传、种族差异、与其他疾病的交互作用的有关，所以对于它们之间作用机制的研究需进一步加强。万方数据 综述5．3MASP-2与其他疾病除了感染性疾病和肿瘤，MASP．2还与多种疾病相关。Isabela．G首次证实MASP．2缺陷在风湿性关节炎患者的病程发展中扮演了重要角色[5—1。另有一些研究认为当MASP．2缺陷伴随其他疾病或免疫抑制时，可引起更严重后果，如囊胞性纤维症或移植手术后，MASP．2缺陷可引起严重病变及易并发各种感染【581。研究还发现在急性心肌梗死患者的末梢循环水平MASP．2浓度显著降低，表明MASP．2参与了缺血性心肌损伤的疾病过程[591。不仅如此，MASP．2在胃肠道缺血再灌注损伤的过程中也有参与[60]；另一项有趣的研究发现MASP．2的浓度与恐慌症的发生有关，但具体机制尚不清楚【61l。6总结与展望目前对于MASP．2及其参与的甘露糖结合凝集素途径的免疫防御体系与疾病的关系研究是一个热点，关于MASP．2结构的研究虽然相对成熟，但在功能性研究方面还不明确，现有的报道多仅限于与疾病的相关性方面，具体的作用机制研究还不成熟，有待我们进一步的深入探索。参考文献1VargaL，SzeplakiGLakiJ，eta1．Depressedactivationofthelectinpathwayofcomplementinhereditaryangioedema[J]．ClinExpImmunol，2008，153(1)：68-742SorensenR，ThielS，JenseniusJC．Mannan-binding—lectin·associatedserineproteases，characteristicsanddiseaseassociations[J]．SpringerSeminImmunopathol，2005，27(3)：299-3193GalP，HarmatVKocsisA，eta1．AtrueautoactivatingenzymeStructuralinsightintomannose·-bindinglectin——associatedserineprotease--2activations[J]．JBiolChem，2005，280(39)：33435-334444WallisR．Interactionsbetweenmannose-bindinglectinandMASPsduringcomplementactivationbythelectinpathway[J]．Immunobiology,2007，212(4—5)：289-2995DegnSE，ThielS，JenseniusJC．Recombinantexpressionofthe万方数据 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综述mannan-bindinglectin-associatedserineprotease-2inhealthyindividua1s[J].ImmunolMethods，2003，282，1-2:159-16749万方数据 致谢致谢在此论文完成之际，首先，我衷心的感谢我的导师吴淑慧教授、贾天军教授。感谢二位导师在科研和论文撰写过程中给予我精心的指导和悉心帮助。同时，导师广博的专业知识、严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，正直无私的人品和乐观豁达的人生态度深深地感染和激励着我。使我在专业知识、科研水平及生活态度等各方面都受益匪浅。在此对二位导师致以最诚挚的谢意。衷心感谢河北北方学院检验学院的各位老师，是他们的热情帮助使我最终顺利完成了实验，并且培养了我严谨的治学态度、精益求精的科研作风及积极进取的工作态度，这将成为我今后工作、学习所追求的目标。衷心感谢河北北方学院附属第一医院和251医院的各位老师、同学，在资料收集过程中给予我的大力支持和热心帮助!衷心感谢河北北方学院的各位研究生同学在实验过程中给予我的帮助!衷心感谢河北医科大学研究生学院和河北北方学院研究生部全体老师的指导、支持与大力帮助!衷心感谢单位领导和同事对我的支持和帮助!衷心感谢所有关心、支持和帮助过我的同学、朋友!最后我还要衷心感谢家人对我的体谅、支持和鼓励!万方数据 个人简历个人简历一、一般情况姓名马微性别女民族汉出生年月1983年11月8日籍贯河北保定二、个人经历2002年9月至2007年7月河北北方学院护理专业本科2007年7月至2012年9月张家口学院2012年9月至今河北医科大学病原生物学专业硕士研究生三、发表论文1宋巧丽，马微，殷晓宁．加强医学免疫学与临床学科教学联系的探讨．中国病原生物学杂志，2013，8(6)：1．52马微，殷晓宁．循证护理在ICU患者压疮护理中的实践应用．中国卫生产业，2012，1(3)：26．283姜文静，马微．胰岛功能测定与B细胞总量分析．河北北方学院学报，20】2，8(2)：11．】2四、获奖情况1河北省高、中等院校临床技能考核优秀指导教师河北省教育厅，河北省卫生和计划生育委员会2014．112河北省高、中等院校临床技能考核优秀指导教师河北省教育厅，河北省卫生厅2013．083张家口市年度工作嘉奖张家口市人力资源和社会保障局2013．03五、承担或主研课题情况1河北省教师教育学会课题(JJS2012．432)：《护理专业开展人文素养教育的现状及对策研究》，第一主研人。2张家口学院青年课题：《护理专业实验室制度化管理探索与实践》，第一主研人。万方数据 个人简历3张家口学院教学改革项目：《护理专业校内集中实践教学模式的改革》，第三主研人。万方数据