fitc-annexinvpi双染色法检测凋亡细胞的

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1、细胞生物学实验FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞一、实验目的a)了解凋亡细胞的变化及检测方法。b)了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。二、实验原理a)细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cellsuicide）。膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。b)细胞坏死（cellnecrosis）：是由外部化学、物理或生物因素

2、的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cellmurder）。c)喜树碱（camptothecin，CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导肿瘤细胞凋亡。d)AnnexinV是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合但不能通过正常细胞膜的物质。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。e)细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧，FITC标记的AnnexinV（AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。细胞凋亡中晚

3、期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。f)激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜

4、图像模糊的缺点。多通道LSCM还可同屏采集显示3个不同发射波长的荧光色及1个混合色图像，对研究2种或2 种以上物质的共存有明显优点。在显微镜的载物台上加一个微量步进马达控制载物台的升降，最小步进距离为0.1μm，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本的各个光学横断面的图像，实现“光学切片”的目的。通过不同的焦平面产生的光学切片，可得到一块较厚标本的三维图像，这是LSCM最重要的作用之一。将存储在计算机中的光学切片的焦平面信息结合起来，即可描述该标本的三维图像。目前LSCM最大有效解析厚度为0.45mm，扫描最小距离为0.1μm。g)流式细胞分

5、选仪的作用原理：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均5细胞生物学实验匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测

6、量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率

7、。一、实验仪器及试剂a)材料：提前7天接瘤，并在实验前24~48h腹腔注射用生理盐水配制的羟基喜树碱溶液诱导凋亡。b)试剂：i.1mg/mL羟基喜树碱溶液。ii.0.01mol/LPBS（pH7.4）。iii.AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒。iv.2mg/mL的PI贮存液：用pH7.4的PBS配制，-20℃保存（3个月）。用时在PBS中稀释1500倍。v.5mg/mLDAPI贮存液：甲醇配制，-20℃保存（3个月）。用时在PBS中稀释10000倍。c)用品i.激光共聚焦显微镜、10mL低速离心机、流式细胞分选仪ii.剪刀、10mL一次性注射器及

8、针头、乳胶手套、酒精棉球、10mL离心管、胶头吸管、EP管、10mL离心管、载玻