AnnexinV,PI双染凋亡细胞检测protocol.doc

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1、annexinＶ-FITC(FL1通道)+PI（FL2通道）双染细胞，FITC阳性＋PI阴性细胞百％就是早期凋亡％。一、原理磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将AnnexinV进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光

2、显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。二、方法1、调整待检测细胞浓度为106个/ml，取200ul，1000rpm×5min(4℃)。2、预冷的PBS1ml润洗两次2，1000rpm×5min(4℃)。3、将细胞重悬于100ulbindingbuffer，加入2ulAnnexin-V-F

3、ITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。4、转至流式检测管，加入400ulPBS，每个样品临上机前加入1ulPI（50ug/ml），2分钟后迅速检测。5、同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。三、注意事项1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测四、结果判定以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；左上象限为机械性损伤细胞；右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；左下为阴性正常细胞；右下为早期凋亡细胞。