抗人cd80单链抗体scfv)及双价抗体diabody)的研制及生物学功能初步研究

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1、抗人CD80单链抗体(ScFv)及双价抗体(diabody)的研制及生物学功能初步研究中文摘要中文摘要CDS0(也称B7．1)是B7家族重要的共刺激分子。人CD80分子编码基因定位于人类染色体3q13．3．q21区内，含有1491bp。CD80是分子量约为44．54kD的I型跨膜糖蛋白，主要表达在专职性抗原提呈细胞(antigen．presentingcell，APC)树突状细胞、单核．巨噬细胞及B淋巴细胞。CD80分子的配体为表达在T淋巴细胞表面的CD28和CTLA．4。CD80与CD28结合为T细胞的活化提供第二信

2、号，促进T细胞的增殖与分化；而与CTLA-4结合介导抑制信号，从而下调或终止T细胞效应。若缺乏此共刺激信号，抗原特异性的第一信号非但不能有效激活特异性T细胞，反而导致T细胞无能，或者耐受。研究表明，CD80介导的信号通路不仅能调节T细胞活化过程，而且还参与许多疾病的发生发展及预后状况。单链抗体(single-chainvariablefragment，ScFv)是一种小分子的抗体，含有完整的抗原结合位点，由重链可变区(thevariableheavychain，VH)和轻链可变区(thevariablelightcha

3、in，VL)通过一段连接肽连接而成，大小为26．28kDa。VH和VL之间的连接肽长度为10．25个氨基酸，最为普遍的为(Gly4Ser)3十五肽。Diabody是单链抗体的二聚体形式，是通过将单链抗体VH和VL之间的连接肽缩短至3．10个氨基酸时，可促进分子间VH和VL的配对而形成。第一部分抗人CD80单链抗体(SeFv)的研制及生物学功能初步研究1．目的：构建及表达抗人CDS0单链抗体(ScFv)，鉴定其抗原抗体结合活性，并初步研究其生物学功能。2．方法：采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80McAb的杂交瘤细胞株

4、(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L．VH．Linker-VL单链抗体基因，并克隆至plRES2．EGFP表达载体，脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，(3418加压筛选。纯化抗人CD80．ScFv，分析其效价，并鉴定其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗人CDS0．ScFv与相应抗原的结合能力。MTT中文摘要抗人CDSO单链抗体(ScFv}及双价抗体(diabody)的研制及生物学功能初步研究法体外分析抗人CD80．ScFv对Raji细胞体外增殖的抑制作用和对CD80介导

5、的共刺激信号的阻断作用。3．结果：构建的抗人CD80．ScFv基因全长为828bp，经测序含有信号肽和连接肽编码基因。实验获得稳定分泌细胞株(命名为SA．II)。上清中抗体得率为15．12m∥L，相对效价为2．0}lg／5x105个细胞。该抗体与天然表达CD80分子的Raji和Daudi细胞阳性结合率分别为96．6％和95．O％。抗人CD80．ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98．67％，并能抑制Raji细胞的体外增殖，而且能阻断CD80介导的共刺激信号转导，抑制PBMC的增殖，增殖率下降43．48

6、％。4．结论：成功构建的表达抗人CD80一ScFv的细胞株，其分泌的抗体具有良好的生物学活性。该抗体的研制在CD80及相关分子的基础或／及临床研究中具有重要的应用价值。第二部分抗人CD80双价抗体(diabody)的研制及生物学功能初步研究1．目的：构建及表达抗人CD80双价抗体(diabody)，并初步研究其生物学功能。2．方法：PCR法获得轻重链可变区基因，构建表达载体plRES2．EGFP／diabody。将plRES2．EGFP／diabody转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，G418加压，筛选稳定高表达细胞株，

7、扩大培养并收集上清，经镍柱纯化，并经变性及非变性SDS—PAGE电泳对抗体分子的双体性进行鉴定。以鼠源性亲本抗体4E5为对照，测定抗人CD80．diabody的效价。采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析抗体与细胞膜型CD80分子的结合活性及与鼠源性亲本抗体4E5的竞争抑制效应；MTT法分析该抗体对天然高表达CD80的Raji细胞体外增殖的影响，同时分析其对CD80介导的共刺激信号阻断作用的影响。3．结果：成功构建抗人CDS0．diabody表达载体，基因全长为798bp，含有信号肽和Gly4Ser连接肽编码基因。获得

8、了稳定分泌双价抗体的细胞株(命名为SA—III)，培养上清中纯化抗体的得率为15mg／L，PAGE结果显示其为一个二聚体，Mr约为53kDa(抗人CD80．ScFvMr约为27kDa)。抗人CDS0．diabody的效价为1．5pg／5x105Ⅱ抗人CD舳单链抗体(ScFv)及双价抗体(diabody)的研制及生物学功能初步研究中