蛋清溶菌酶的研究

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1、1前言1.1溶菌酶溶菌酶(Lysozyme,EC)又称细胞壁溶解酶（Muramidase）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。根据作用

2、位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间β-1,4糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图1-1。根据来源不同可分为：T4噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：C型(chicken-lysozymetype)、G型(goose-type)和I型(invertebrate-type)溶菌酶。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。本文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即

3、C型溶菌酶。图1-1胞壁质水解酶的类型及其水解位点Fig1-1TypesofMureinhydrolasesandtheircatalyticsitesonpeptide.1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。当有EDTA存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%~3.5%，由18种129个氨基酸残基组

4、成，分子量为14.4kDa，等电点为11.1，最适温度为50℃，最适pH值为6~7，其化学性质非常稳定，在pH1.2~11.3范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也比较稳定，在pH4~7、100℃处理1min后活性基本不变，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下热稳定性较差。1.1.2蛋清溶菌酶的结构和功能蛋清溶菌酶的构象比较复杂，α-螺旋仅占25%，同时存在着伸展的β-片层结构，其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链，溶菌酶的分子结构见图1-2。图1-2溶菌酶的分子结构示意图Figure1-2MoleculestructureofLysozyme.它具有4对二硫键(6

5、Cys–127Cys,30Cys–115Cys,64Cys–80Cys和76Cys–94Cys)，这几对二硫键在经变性剂或热处理后均能保持稳定，但是很容易被还原剂破坏溶菌酶的活性位点为35位的谷氨酸(Glu35)和52位的天冬氨酸(Asp52)。一般认为蛋清溶菌酶具有胞壁质酶活性，即通过活性中心Glu35和Asp52的作用，催化水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键。Glu35作为糖苷键的质子供体，剪切底物的C-O-C键，Asp52处在一个明显的极性环境中，参与生成糖基酶中间体，然后与水分子发生反应，水解生成产物。溶菌酶通过此胞壁质酶活性，破坏细胞壁的肽聚糖，

6、导致细菌细胞壁的逐渐瓦解，内容物外流，从而最终导致菌体死亡。1.2溶菌酶的应用1.2.1溶菌酶在食品工业上的应用①溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度（通常为0.05%）的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐、保鲜的作用。②用于新鲜海产品和水产品的保鲜一些新鲜海产品和水产品在0.05%的溶菌酶和3%的食盐溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行常温或冷藏贮存，均可延长其贮存时间。③在糕点和饮料上的应用在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶也可起到

7、一定的防腐作用。在pH值6.0~7.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。④在保健食品添加剂上的应用溶菌酶是高盐基蛋白质，具有一定的保健作用；有抗感染及抗生素效力增强作用，有血液凝固和止血作用，有组织再生和形成促进作用等。1.2.2溶菌酶在生物工程上的应用溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰氏阳性细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取。只要把对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶