蛋清溶菌酶分离纯化探究进展

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1、蛋清溶菌酶分离纯化探究进展摘要：溶菌酶（Lysozyme）是一类特异性作用于微生物细胞壁的水解酶，广泛应用于食品添加剂、临床医疗、免疫等方面。从蛋清溶菌酶分离纯化研究方面进行阐述，介绍蛋清溶菌酶提取工艺，以及蛋清溶菌酶活性与纯度测定的方法，并对未来蛋清溶菌酶的分离纯化工艺的发展进行展望。关键词：溶菌酶蛋清分离纯化酶活性中图分类号：TQ464文献标识码：A文章编号：1007-3973(2013)003-073-02溶菌酶是一种安全无毒的蛋白质，能选择性地分解微生物细胞壁，而不影响其它组织，因而具有良好的溶菌作用，它是一种安全可靠且性能良

2、好的杀菌剂，已广泛应用于食品防腐、医药制剂、化工等行业。自然界中，鸟类和家禽蛋清中溶菌酶含量较多，约为0・2%〜0.4%。溶菌酶的产量直接影响着溶菌酶的应用。选择合适的，经济的分离纯化方法仍是当前研究重点。目前溶菌酶分离纯化的方法主要包括结晶法、膜色谱、沉淀法、离子交换法、反胶团萃取、电泳法、双水相萃取、亲和沉淀等。新的大规模生产工艺也将随市场需求而不断涌现。1溶菌酶研发历程溶菌酶是一类特异性作用于微生物细胞壁的水解酶，常见的有几丁质酶、内-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、磷酸甘露糖酶、脱乙酰壳多糖酶等。从蛋清中提取得到的溶菌酶由129个氨

3、基酸残基组成，是一种碱性蛋白质，有四对二硫键，富含碱性氨基酸。人们对溶菌酶的研究从上世纪初开始，而有关溶菌酶的研究报道最早是1907年NicoHe等学者发表的关于桔草芽胞杆菌溶解因子的存在。Flemmning等于1922年发现具有强力溶菌活性的成分存在于人的鼻涕、唾液等中，并把具有溶菌活性的这些因子统称为溶菌酶。Salton等人的研究证明，溶菌酶能够切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间糖昔键，从而破坏细胞壁支架，使细胞在渗透压的作用下裂解。Ph订lips等人用X射线衍射法阐明了溶菌酶的三维结构。1967年，英国菲利普集团首先报道

4、了溶菌酶作用底物复合体的X射线衍射，阐明了其结构。这些研究无论对蛋清溶菌酶的研究，还是在近代酶化学研究史上都有着举足轻重的地位。随着生活水平的提高和科学技术的进步，在药物和食品中添加化学药品开始被许多国家限制，因此具有天然活性的溶菌酶因其高效且安全而深受关注。溶菌酶研究虽然在我国起步较晚些，但国家近20年投入了巨大人力和财力对溶菌酶的分离提取及开发应用进行了大量的研发工作，尤其上世纪有关蛋清溶菌酶技术的研究多次被列为国家级重点攻关项目。然而，与国外相比，我国的溶菌酶制造业规模仍然有较大差距，生产技术仍相对落后。因而目前国内高活性蛋清溶

5、菌酶的生产供应还不能满足我国日益增长的需求。2蛋清溶菌酶的提取方法目前蛋清溶菌酶的提取方法主要有直接提取法、超滤法、亲和膜层析法、离子交换法、反胶束萃取法、结晶法和沉淀法等方法。直接提取法是依据溶菌酶的理化性质，利用溶菌酶和杂蛋白等电点的差异，通过调节pH值来沉淀蛋白，达到分离溶菌酶的目的。该方法操作简单，但产品纯度低。超滤法则是根据膜孔径的大小，在压力的驱动下将分子大小不一的溶质分离，从而获得目标物。超滤法是一种相对新兴的分离技术，产量和纯度都较高。层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交

6、换层析法等。尤其是离子交换层析法20世纪80年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。2.1结晶法溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入（NH4）2S04等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的pH,再加入溶菌酶晶体进行诱导，4*放置大概2周，即可析出大部分的溶菌酶晶体

7、,而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响，所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于

8、常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。2.2离子交换法离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化