检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响

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1、检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响摘要：需要对精子功能用快速、灵敏的方法进行评估。由于精子是由不能够受精的卵母细胞经历了一系列复杂的生理变化才获能的，评估精子在体外的受精条件下的功能是合乎逻辑的，在这项研究中，精子在体外条件的能力，是由离子载体和由存储在公猪精液的细胞内钙离子的浓度的变动来进行调控的。在32和20℃稀释公猪精液存储在16和10℃下24和72小时，钙离子载体引起的变化和增加细胞内钙离子的含量在条件下孵化过程中作为时间的函数用流式细胞仪检测和记录的精子的运动能力。所有的反应参数（膜有缺陷的精子顶体反应的精子，细胞与细胞内钙水平高的比例增加）被证明是发生

2、在低储藏温度下敏感微妙的生理变化。精液储存在10℃下精子具有高的钙含量初始水平较高的，但细胞内钙的积累是低于精液存储在16℃下。膜的完整性和和增加的比例高顶体反应细胞精液储存在10℃下在20°C稀释对细胞膜的完整性和反应性没有影响，精液存储在24h和72h的条件下对膜的完整性，顶体反应及细胞内钙能后处理没有明显的差异。然而，在一定程度的细胞凋亡和顶体反应显示储存72h后精子的运动能力加速，特别是当精液储存在10℃下可以得出结论，精子膜反应性和动力学参数的同时使用是一个敏感的工具，用于公猪精液检测与存储相关的膜变化。关键词精子、存储、获能、反应、顶体反应、钙离子内流、动力

3、学1、简介射精后，精子经过一系列复杂的生理变化统称为获能，这使他们能够相互作用和融合卵母细胞[1]。在体外获能处理的前两个小时，大量的钙离子内流发生在公猪精子发生中的外源凝集素结合能力的变化和诱导刺激顶体反应[2-5]。通过施加不同的生理和非生理性刺激可以诱导在精子顶体反应[1]。尽管响应于透明带或透明带蛋白似乎是最像生理诱发和非常有效的公猪精子[6-7]，钙离子载体A23187也可被用于在其他物种中的精子评价[8-11]。由于射出的精子直到完成获能才具备与卵母细胞结合的能力，可以合理地推断精子功能的评估必须在运动状态下充分的评估精子的功能[12]。由于个别男性的敏感性

4、，诱导获能的精子参数的变化，在过去的几年中成为一种广泛使用的来确定精子的功能的诊断工具。然而，关键的记录膜的变化的影响必须进行批判性评估。在女性体内精子存储在输卵管尾部区域[13]仅在有限的时间可以生存。显然，和获能抑制与上皮细胞的相互作用过程中无产能精子可以选择性绑到输卵管，在许多研究中已被证明在各种精子输卵管系统[14-17]。此外，这似乎有可能完成从输卵管释放后获能发生[18-19]。精子获能一直被视为一个涉及一系列积极的,不稳定的事件随后膜变性的过程。在一定的时间段，精子获能后能够高速的蠕动，并进行透明带诱导的顶体反应。在精子大量产生直至排卵维护膜的完整性的必要

5、水平的，精子在很短的时间内发生的不稳定和体外获能过程可能是不连续的。另一方面，获能要完成出现在壶腹排卵后不久的峡部交界处的流体成分的协同作用[18-21]，并且卵母细胞的寿命是有限的，因此，在体外进行的获能变化的能力非常低可能也无法反应体内获能的情况。因此，估计精子反应能力的条件和动力学的检测精子功能的变化是一个有用的工具。然而，除了这样的方法和个别的影响对获能诱导变化的灵敏度，其实用性取决于它的存储引起的条件变化的敏感性。另一个要考虑的因素是采用存储在质膜中引起的变化的参数的灵敏度。对于实验的实用性，最好是使用存储24和72h之间，而不是在同一天收集和使用新鲜精液的稀

6、释液。然而，冷却至低温（5°C），甚至是中度（15°C）的温度诱导获能样的变化[22--23]，而这种现象可能会导致加速影响到随后的一系列获能反应。如果精子膜被保持在一个影响获能条件状态和细胞中，则该维护的期间内使用的精子样品没有明显的限制。在人工授精，公猪精液的稀释和存储过程对精子是一个额外的冲击。公猪精子是由对温度非常敏感的脂质组成的质膜[24-25]，选择合适的温度稀释和存储可能是非常重要的。公猪精液稀释的存储通常在15至17°C。然而，提供稀释的样品，特别是在冬天是受温度变化影响的。这种变化的关键作用只有少数的研究对其进行了评估[26]。因此，本研究公猪的精子在

7、储存过程中的功能状态的影响，稀释温度，储存温度，储存时间延长72小时的响应参数与体外获能（钙离子内流和顶体反应）。2、材料和方法2.1、试剂及方法除另有说明外，试剂由MerckAG,Darmstadt,Germany;AlexisGmbH,Gru¨nberg,Germany;andSigmaAG(Sigma–Aldrich),Steinheim,Germany.等公司购买。使用碳酸氢盐的Tyrode平衡盐溶液（pH值7.4，300mOsm/kg）体系，由96mM的NaCl，3.1mM的KCl，5mM葡萄糖，0.4mM的用MgSO4，15m