《简并引物设计》word版

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1、简并引物设计的方法简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。简并引物设计的常见程序如下：1.利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。2.对所找到的序列进行多序列比对。将搜索到的同一基

2、因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，网址：http://bioinformatics.weizmann.a...ww/make_blocks.html。也可选工具有ClustalW。3.确定合适的保守区域。设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有4个氨基酸。若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求

3、，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。4.利用软件设计引物。当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer5.0进行设计。但最好使用专门的简并引物设计的方法如：CODEHOP（网址：http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html），GeneFisher2（网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genef

4、isher2/）。在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。该方法主要是通过将简并区放在3′末端，并在5′端设计一个一致性的区域来降低兼并度，详见http://www.helixnet.cn/thread-8194-1-1.html。5.对引物的修饰若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和

5、根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库网址：http://www.helixnet.cn/viewthrea...ht=%C3%DC%C2%EB%D7%D3）。注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。引物中符号说明：A代表AC代表CG代表GT代表TM代表AorCR代表AorGW代表AorTS代表CorGY代表CorTK代表GorTV代表AorCorGH代表AorCorTD代表AorGorTB代表CorGorTN代表GorAorTorC简并引物设计过程（1

6、）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。（2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有ClustalW/X,也可在线分析。所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。（3）确定合适的保守区域设

7、计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。（4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件

8、来设计引物了，其中Primer5.0支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer5.0中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核