实例图解简并引物设计内容.pdf

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1、2013-10-27实例图解简并引物设计（By Raindy） 【絮语】设计一对合适的引物是PCR扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖PrimerPremier（以下简称PP）或Oligo等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y病毒CP基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛

2、砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、童鞋批评指正。【相关工具】（1）MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑（2）DNAMAN8-检测两引物的互补性（3）OligoCalc-评估引物的属性（4）WebLogo3-直观显示简并碱基-------------------------------------------------【华丽分割线】-------------------------------------------------【基本原则】设计一对好的引物，归结起

3、来就是5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：（1）两引物的序列要与模板的序列紧密互补；（2）两引物不能在模板的非目的位点发生错配；（3）两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。【延伸原则】（1）引物长度：常用为18-27bp，最大不可超过38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合DNA聚合酶反应；（2）GC含量：一般介于40%-60%之间，且两个引物之间的GC含量相差不能过于悬殊；（3）碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的GC，GC富集区容易导致错误引发反应。【特别注意】5′端引物

4、的作用主要限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3′端开始的，所以3′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：  （1）不要终止于密码子的第3位  （2）末位碱基避免使用碱基A  （3）避免出现3个以上连续的G或C，如GCG或CCC或GGG  （4）ΔG的绝对值不可超过9  （5）与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8个互补碱基同源  （6）不能进行任何修饰----------------------------

5、-----------【华丽分割线】-------------------------------------------------【设计流程】【示例背景】马铃薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）是侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR技术具有高度的特异性和灵敏性等特点，已经成为PVY检测最常见的方法。但由于PVY株系分化严重，不断有新的重组株系产生，单一的特异性引物无法适应PVY不同株系的检测需求，需要设计一对简并引物以能够满足生产上

6、的检测需求。【详细图解】1.序列准备：（1）GenBank下载PVY全基因组序列（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT多重序列比对（3）扩增片段区域选择，CP基因长度及位置如下图所示：先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输入CP基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv”和8391那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。裁切后得到CP基因编码区序列，“Ex

7、portAlignment”导出CP基因序列（推荐fasta格式）。2.引物设计推荐先设计3′端引物，至于原因，上面的【特别注意】中已提到，这里不再赘述。（1）选择引物序列综合考虑引物设计原则及特别注意，在CP基因3'端位置选取一段合适的序列（784-803bp），804bp位置为A且是第三个密码子位置，所以弃去末位的A碱基。-------------------------------------------------------------------------------------------

8、--------PS：是否位于密码子的第3位，可以通过“TranlatedProteinSequences”-“DNAsequences”切换查看，如下图，CP基因的末端3个碱基是终止密码子所在的位置，A是第三位密码子。---------------------------------------------------------------------------------------------------（2）生成S