db51t 1210-2011 马铃薯x病毒检验鉴定技术规程

《db51t 1210-2011 马铃薯x病毒检验鉴定技术规程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、65.020.01B16DB51四川省地方标准DB51/T1210—2011马铃薯X病毒检验鉴定技术规程2011-01-25发布2011-03-01实施四川省质量技术监督局发布DB51/T1210—2011目次前言II1　范围12　规范性引用文件13　术语和定义14　原理15　试剂与材料16　仪器及用具37　取样38　实验室检验39　结果判定410　样品保存4附录A（资料性附录）　马铃薯X病毒基本信息5附录B（资料性附录）　马铃薯X病毒DAS-ELISA检验程序6附录C（资料性附录）　马铃薯X病毒RT-PCR检验程序8I

2、IDB51/T1210—2011前言本标准分为范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂与材料、仪器及用具、取样、实验室检验、结果判断、样品保存等部分。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准起草单位：四川省植物检疫站。本标准主要起草人：宁红、郭迪金、谭家兴、谢成伦、万佳、熊玉兰、杨重渝IIDB51/T1210—2011马铃薯X病毒检验鉴定技术规程1　范围本标准规定了马铃薯X病毒（见附录A）的取样、实验室检验、结果判断及样品保存的技术要求和方法。本标准适用于马铃薯感染马铃薯X病毒的检验和鉴定。2　规范性引用文件下列文件对

3、于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB15569-2009农业植物调运检疫规程DB51/T868-2009马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒检验鉴定技术规程3　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1　目标条带targetband根据某种病毒RNA序列中一段保守的、特异的碱基序列设计特异引物，通过RT-PCR扩增和电泳检测，得到的与引物设计长度吻合的RT-PCR扩增条带。目标条带的存在，是判断某种

4、病毒存在的标准。本标准中PVX的目标条带为625bp。注：改写DB51/T868-2009,定义3.6。4　原理马铃薯X病毒田间通过蚜虫和农事操作进行传播，远距离主要通过人为的引种、商品流通等途径传播，带毒块茎和种苗是该病毒远距离传播的主要载体，该病毒具有潜隐性，根据病害症状很难确定马铃薯X病毒，薯块上一般不表现症状。采用免疫学和分子生物学方法，可快速根据有关判断标准进行马铃薯X病毒检验鉴定。5　试剂与材料除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.1　免疫学检验试剂免疫学检验试剂

5、包括：XDB51/T1210—2011——捕捉抗体（Captureantibody）马铃薯X病毒免疫球蛋白，抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于4℃条件下备用；——酶标抗体（Alkalinephosphataseenzymeconjugate）用碱性磷酸酶标记的马铃薯X病毒的免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃条件下备用；——包被缓冲液（Coatingbuffer）取2.93g碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59g碳酸钠（Na2CO3）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调pH值到9.

6、6，贮藏于4℃条件下备用；——洗涤液(PBSTBuffer)取1.15g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g无水磷酸二氢钾（KH2PO4）、8.0g氯化钠（NaCl）、0.5g吐温－20，用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4；——样品提取液（GEBbuffer）取1.3g无水硫酸钠（Na2SO4）、20.0g聚乙烯吡咯烷酮（（C6H9NO）24-40000）、0.2g叠氮化钠（NaN3）、2.0gⅡ级鸡蛋清白蛋白粉、20.0g吐温－20，用1000mL洗涤液溶解，并调整pH值到7

7、.4，贮藏于4℃条件下备用；——酶标抗体稀释缓冲液（ECIBuffer）取0.2g牛血清白蛋白（或脱脂奶粉）、2.0g聚乙烯吡咯烷酮（（C6H9NO）n）、0.02g叠氮化钠（NaN3），用100mL洗涤缓冲液溶解，并调整pH值到7.4，贮藏于4℃条件下备用；——底物缓冲液（PNPBuffer）用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁（MgCl2）、0.02g叠氮化钠（NaN3）、9.7mL二己醇胺CH2CH2OH）溶解后，用盐酸调pH值到9.8，定容到100mL，贮藏于4℃条件下备用；——底物溶液（PNPsubstate

8、）将5mg对硝基苯磷酸盐（C6H5NO3）溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前15min内，避光条件下制备；——终止液12g氢氧化钠（NaOH）溶于100mL蒸馏水。1.1　RT-PCR检验试剂RT-PCR检验试剂包括：——莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（MMLV）100U/μl；——1×TAE缓冲液40