针对致病菌株的大量保守

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1、副猪嗜血杆菌三聚自转运蛋白：针对致病菌株的大量保守结构域的表达 编译者按：副猪嗜血杆菌是目前困扰生猪养殖业的主要致病菌之一。本文通过对副猪嗜血杆菌的三聚自转运蛋白的结构特征，侵袭性和非侵袭性菌株的结构域差异等的研究，旨在进一步了解该病致病株在组织的定植和侵袭特点。摘要副猪嗜血杆菌是Glasser’s疾病的病原菌，但关于该病的致病性因素目前知之甚少。本文中，我们将就致病株Nagasaki，描述13个三聚自转运蛋白的分子特征，这些自转运蛋白由YadA的C-端转位分子区域所组成，这些转位分子被分为三组。所有结构域都拥有模体和一些重复序列，这些模体和重复序列具有粘附素，红血球凝集

2、素和侵袭素的一些特征，在其中心，有不同的胶原样重复拷贝。这些区域结构共享H.somnus129Pt的两个三聚自转运蛋白。通过微点阵杂交对基因组进行比较，论证了H.parasuis毒力株的同族关系和非毒力株的高变异性。因此，这些基因被命名为vtaA(毒力相关型三聚自转运蛋白)。对不同侵袭性菌株的17种同族体vtaA基因的测序阐明了一个广泛存在的镶嵌结构。基于在vtaA基因中DNA吸收的信号序列，我们采用了一种演化机制，通过该机制，基因复制，变化的累积量以及基因重组，加上横向基因结构域的转移，都导致多基因家族的多样性。本研究有助于了解副猪嗜血杆菌致病株组织定植和侵袭特点。 引

3、言17对于细菌定植和存活而言，针对宿主组织的粘附素是一个重要因素。粘附素是细菌表面的一种结构，介导同宿主细胞的相互作用。粘附素在本质上各不相同，在其中一个三聚自身载体中，该载体也被称为AT-2家族，出现在革兰氏阴性菌中。该家族具有结合真核细胞和胞外基质蛋白的能力。这些蛋白质含有一个N-端信号肽，一个娩出成分，和一个负责在细胞外膜形成孔隙的C-端领域。娩出成分常常包含多重具有粘附素和红细胞血凝素的重复序列（Hep-Hap）和基本序列(HIM)。尽管在不同种类细菌之间，转为分子区域的氨基酸变化很大，但它们仍形成β-序列，通过该序列，娩出成分得以移至胞外17。它们的免疫原性使它

4、们有望成为理想的疫苗。在流感嗜血杆菌，莫拉杆菌，嗜血嗜血杆菌，脑膜炎奈瑟菌，或耶尔森氏菌中，人们已经部分或全部描述了它们的结构，功能及免疫原性等特征。然而，并非所有对致病菌的研究都与重要的人类疾病息息相关。在副猪嗜血杆菌中，该菌属革兰氏阴性，隶属Pasteurellaceae家族，人们对介导针对宿主组织的粘附素或毒力因子的分子结构基本上还知之甚少。副猪嗜血杆菌常见于上呼吸道健康的猪群。某些菌株能够迁移进入肺胀，引起肺炎，甚至引发严重的全身感染，其特点是纤维素性多发性浆膜炎，关节炎，脑膜炎等Glasser’s疾病。虽然到目前为止已经鉴定出15种血清型，但仍然有许多菌株无法定

5、型。尽管在一个既定血清型的表型和H-型副猪嗜血杆菌之间不是严格的一一对应关系，但人们普遍认为，5-型具有高致病性，而3-型毒力较低。该细菌的另一个显著特征是它的遗传变异性。当对120株野株和11株参照株进行多轨迹分型方法鉴定时，发现了109种序列类型。比较有趣的是，共观察到两种分歧，其中一种包括从患病猪中分离到的毒力株中的大多数。尽管在H-型副猪中介导针对宿主组织的粘附素和毒力因子大体上尚不为人知，最近的研究仍然显示：副猪嗜血杆菌菌株中5型和4型（时常被认为与毒性有关）往往首先自体外侵入猪脑血管内皮细胞。由于这种侵袭并不消除蛋白酶K的作用，人们推测，假定的侵袭素不大可能是

6、蛋白质。然而，已描述的细菌粘附素中大多都是蛋白质。本报道中，我们描述了高致病性副猪嗜血杆菌菌株中的13个同源基因以及17个编码VtaA蛋白的不同侵袭性菌株的同簇体，这些同簇体，常称之为AT-2，包含胶原三倍螺旋重复。对来自致病性菌株且不具有非致病性菌株高度分歧特性的vtaA的同簇体而言，娩出成分相对保守。而且，至少针对娩出成分而言，这些多基因家簇很可能涉及重复和横向基因转移。 材料和方法细菌菌株和培养条件副猪嗜血杆菌（表1）培养在巧克力琼脂平板上，置于37摄氏度含5%CO2的环境中，直到长满平板。HP和F9菌株分别由HIPRAS.A实验室（西班牙）和西班牙巴塞罗那自治大学

7、兽医学院从临诊剖检猪上分离得到。细菌悬浮在磷酸盐缓冲液中，经离心回收，并于磷酸盐缓冲液中洗涤两次。来自副猪嗜血杆菌基因组DNA经商品试剂盒抽提，并用Sau3AI17和RsaI（新西兰生物公司）消化或超声降解。之后，DNA降解片段用T4聚合酶连接（新西兰生物公司）。DNA片段大小从450到1500bp不等，经琼脂糖凝胶纯化。该基因组按以下方法进行构建：DNA片段被插入到去磷酸化的载体pUC-9(使用新西兰快速链接试剂盒）的BamHI或SmaI克隆位点,并对一株大肠杆菌进行改造。重组质粒DNA的分离使用的是NucleoSpin公司