几种实验用鱼类致病菌株的鉴定-论文.pdf

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1、《水产养殖~2014年第8期痴富酷％doi：10．3969~．issn．1004-2091．2014．08．020王明珠，丁玉z‘·江苏农牧科技职业学院江苏泰州2253C0；2．i意研究所挺苏南京2107)近年来，我国水产养殖业发展迅猛，各种病害1．3仪器的发生也越来越普遍，细菌性疾病已成为鱼类最严恒温培养箱，摇床，磁力搅拌器，显微镜以及成重的传染性疾病。该类疾病种类很多，常见的有败像系统等。血症、烂鳃病、白皮病和肠炎等，主要的病原菌有嗜1．4实验动物水气单胞菌、柱状嗜纤维菌、副溶血弧菌和荧光假草鱼，体长约15cin，重约35g／条。单胞菌等[1-8

2、1，防治方法主要是药物防治，抗病育种2方法和免疫防治亦有报导。近年来笔者开展了对鱼类细2．1常规鉴定菌性疾病免疫学诊断和治疗的研究，对数种鱼类致各菌株纯培养后，分别接种于肉汤、营养琼脂、病菌进行了鉴定，为相关药物产品的研制和临床试麦康凯、LB和TSA培养基，在28℃培养34d，革验提供科学依据。兰氏染色后镜检，观察菌落形态、运动能力，使用1材料300~g／mL的氨苄霉素(Amp)、150txg／mL的卡那霉1．1菌株素(kana)检测抗性，通过MR、vP、吲哚以及其他相获得菌株6种，编号为Bl至B6，菌种和来源关生理生化试验进行常规鉴定。如表1。2．

3、2外毒素的检测表1菌种来源表通过溶血试验鉴定外毒素，按常规方法制备5％～10％血琼脂平板，将各菌株分别划线接种，置于37培养箱中避光培养24h，若在菌落周围形成半透明草绿色溶血环判为仅溶血，菌落周围形成透明的溶血环判为B溶血，若菌落周围无溶血现象判为溶血。2-3胞外蛋白酶(ECP)的检测无菌制备1％～2％脱脂奶平皿，将各菌株分别划线接种于脱脂奶平皿后，置28℃培养24～48h观察，若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，则为阳性，否则阴性。2．4动物致病性试验1．2主要生化试剂对草鱼进行攻菌，每组30尾，其中试验用20肉汤、营养琼脂、麦康凯、LB和TSA

4、培养基，血尾，对照用10尾；用LB液体培养基培养各菌株20琼脂平板，1％～2％脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，革兰h．用比色法测细菌浓度，取0．5mL，按照浸泡和腹氏染色试剂，氨苄青霉素，卡那霉素。腔注射两种方式来进行攻菌，同时用无菌LB培养曰痴害防《水产养殖)2014年第8期基做对照，草鱼饲养在水温约28℃的水族箱内，每3．3菌株主要生化指标天换水三分之一，观察并记录死亡情况，确定LD卯，实验项目及结果见表3，“+”表示阳性，“一”表示同时从死亡鱼肝、腹、鳍、腮等炎症脏器分离菌加以阴性。结果显示，各菌株相应生化指标与表1显示验证。的细菌特性相符合，3结果3

5、．4外毒素与胞外蛋白酶(ECP)检测结果3．1各菌株主要培养特性外毒素溶血实验除了B6为溶血外，其余皆见表2。为B溶血；胞外蛋白酶各菌株均检测为阳性。3．5动物致病性试验结果表2各菌株培养特性结果结果见表4，采用浸泡和腹腔注射两种攻菌方菌株主要培养特性式，72h内，草鱼的LD分别为3~101~CFU／mL和3x108~9x10sCFU／条。对照组草鱼在7d内表现正28～37Y：用肉汤、营养琼脂、麦康凯、LB和TSA培养基B1皆可培养，菌落光滑、有芳香气味。有运动力，耐300常、无死亡。Ixg／mL的Amp，对150Ixg／mL的kana敏感。4讨论B

6、2同B1近年来，鱼类细菌陛疾病成为水产养殖业的常见危害疾病，相应报道亦有很多。致病菌种以嗜水B3同Bl气单胞菌最为常见，柱状嗜纤维菌、副溶血弧菌和基本同B1，但有恶臭味，菌落边缘粗糙。耐150Ixg／mLB4，，荧光假单胞菌等亦常被检出。本文选用的试验菌的kana。B4．5．6分别是柱状嗜纤维菌、荧光假单胞菌和副溶B5基本同B1，但麦康凯不生长。血弧菌，B1．2．3是嗜水气单胞菌。由表3可见，B6基本同B1，但一般培养基不长或很差，嗜盐。B4．5．6镜检形态和某些培养特征表现出与嗜水气单胞菌明显的不同，三株嗜水气单胞菌关键性的指标3．2革兰氏染色及镜

7、检结果一致，但也有一些生化指标存在差异。染色镜检结果得知，各菌株均为革兰氏阴性杆笔者在研究过程中发现，很多文献对细菌的鉴菌。表3生化试验结果表4草鱼的LD血性和LD蜘两者并不完全对应。实验中还尝试了用PCR检测嗜水气单胞菌毒力基因的方法，发现很多报道的方法并不适用于所有的菌株，调整程序后阴性或非特异性阳性结果可能呈阳性，所以可能存在假阴性误差。定结果存在差异，如一些生化指标。对于致病性鉴本文对嗜水气单胞菌的鉴定主要参考了凌红定以及强弱的判定标准也不一致，如有些文献采用丽㈣等的检验方法，该法未要求进行草鱼动物试验，的是通过溶血性和胞外蛋白酶(EPC)检

8、测法，有些但是考虑到标准的差异性所以还是用动物试验进采用的是动物试验，还有报道指出，有些菌株的溶行了最终确定