引物+++保护碱基列表-百度文库

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1、11月13日引物合成的详解4.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<45baseOPC一般PCR扩增>45basePAGE诊断PCR扩增<40baseOPC,PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC,PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE,HPLC8.如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配

2、制成10-50pmol/ul。一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V(微升)=OD数*（乘）33*（乘）*（乘）20000/(除)引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。注意：1OD260=33ug/ml.9.如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=81.5+16.6xLog10[Na+

3、]+0.41(%GC)–600/size公式中，Size=引物长度。11.如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTrispH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。12.如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要

4、求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。13.合成的引物5’端是否有磷酸化答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。16.长链引物

5、为什么出错的几率非常高？答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。19.TaqMan探针设计的基本原则是什么？答：下列原则供您参考。◆TaqMan探针位置尽可能靠近

6、扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。◆长度一般为18-40mer。◆G-C含量控制在40-80%左右。◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。◆在引物的5’端避免使用G。◆选用比较多的碱基C。◆退火温度Tm控制在68-70C左右。有用的荧光染料参数Name吸收波长发射波长colors6-FAM（6-carboxy-fluorescein）494nm518nmGreenTET  （5-tetrachloro-fluorescein）521nm538nm  OrangeHEX（5-hexachloro-fluorescein）535nm

7、553nmPinkTAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine）560nm582nmRoseROX（6-carboxy-x-rhodamine）587nm607nmRedCy3  （Indodicarbocyanine）552nm570nmRedCy5（Indodicarbocyanine）643nm667nmViolet20.Primer设计的基本原则是什么？答：引物设计的下列原则供您参考。◆引物长度一般在18-35mer。◆G-C含量控制在40-60%左右。◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。◆