报告基因技术

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划报告基因技术　　自然界中广泛分布着生物发光有机体，其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等。在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶，底物则命名为荧光素。自1986—1987年首次被当作报告基因使用以来，荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一。尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异，但有一个共同点，即在生物发光反应体系中均需发生氧化反应。它通过两个步骤使底物荧光素发生氧化作用，而产生发光反应，此反应是ATP依赖性的。杂环荧光素首先腺苷化，然

2、后通过氧化脱羧作用，产生AMP、CO2，并通过激活的荧光素中间产物发射光将反应的试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减的黄绿色闪光，这种光信号可用配备了便于迅速混合。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　将反应物的自动注射装置的荧光检测仪进行检测，也可用标准的液闪仪对光信号进行记录。当底物过量时，发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比，因此，可对荧光素酶报告基因的转

3、录进行间接估计。荧光素酶易被蛋白酶降解，在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3小时。荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法。实验步骤：1．实验第一天，消化并接种细胞于35mm细胞培养皿，置于5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜。2．等细胞密度达到70％时用Luciferase报告基因质粒、LacZ的表达质粒及其它质粒共转染细胞。3．转染24－36小时后，吸去培养液，用冰冷的PBS洗涤细胞。注：荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。4．在每个培养皿中加入350μl预冷的harvestbu

4、ffer,于4oC或冰上放置10min裂解细胞。5．在细胞裂解期间，准备足量的mL微量离心管，将ATPbuffer与luciferinbuffer以1：比例混合成反应液后分装，每管100μl。6．依次取等体积的细胞裂解液至步骤5中的离心管中，迅速混匀，在发光仪上读取吸光值。注：发光反应会迅速衰减，将细胞裂解液加入反应液后5秒内必须读取吸光值。7．确保以相同操作手法读取全部样品吸光值后。8．取剩余裂解液测定LacZ的活性，其读数作为内标用以矫正荧光素酶的读数。9.用矫正后的读数作图，分析数据。注：荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解

5、，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　荧光素酶报告基因原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。　　其原理简述如下：　　构建一个将靶启

6、动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。　　将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。　　加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。　　步骤：　　1、(1)铺细胞于24孔板中，{选用48孔板，铺板密度约为30%。}每孔细胞数为20万细胞左右，待细胞融汇度达到70%、85%时进行转染。一般选用细胞密度为50-7

7、0%时进行转染。转染体系的配置：目标蛋白的质粒，luc质粒，fermentas转染试剂，这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。　　脂质体法目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　在细胞密度达到80%左右，于转染前