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1、双萤光素酶报告基因技术的应用戴吉芮博士技术服务代表Promega北京办事处自然界的萤光发光真菌发光节虫发光海星发光甲壳虫自然界的萤光发光鱼发光甲虫自然界的萤光萤火虫报告基因的作用•细胞信号转导途径•启动子/增强子•受体结合•病毒/细胞相互作用•转录因子•药物诱导作用或”效果”各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶•优越的灵敏度•需要底物–高信号值–无内源活性ß-gal•灵敏度好•细菌，血清等内源活性高•需要底物GUS（葡糖醛酸糖•灵敏度好•90%的E.coli,人／动物细胞中苷酶）•植物中内源活性低有内源活性•酶的扩散可引起“过度报告”•需要底物SEAP（分泌性碱•分泌性报告基
2、因(不需裂•在HeLa,癌和其它细胞类型性磷酸酶）解)中有高的内源活性•需要底物CAT（氯霉素转乙-真核细胞没有背景表达•放射性的酰基酶）-易于使用•灵敏度底-设备现成(液闪仪,层析)•50ｈ半衰期GFP（绿色荧光蛋•显微镜:亚细胞定位•背景可能高白）•不需底物•折叠“情形”可导致信号差别萤光素酶报告基因的主要优点•非放射性。•检测快（比CAT等）。•灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）。•半衰期短。（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）。•线形范围广。（在10-
3、16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）。•一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言)。•生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器。•通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力。萤光素酶报告基因的使用•原理:–制备含有luc/Rluc的DNA调节序列Luc２–转染–提供刺激–测量萤光在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)受体蛋白-蛋白信号转导相互作用转录因子病毒感染调节序列RNAi抑制和增殖萤光素酶基因转录加工RNA酶翻译蛋白质折叠反义RNA启动子/增强子分析•“碰撞启动子”:Light1)全序列:Promoterluc+2
4、)逐步缺失:LightPromoterluc+Promoterluc+FireflyandRenilla萤火虫生物萤光的化学萤光素酶萤光素Oxyluciferin+AMP+ATP+OMg2++PP+CO+Light2i2萤光素酶:单体,61,000Daltons辅-底物:ATP.Mg2+萤光素:海肾萤光素酶反应萤光素酶CoelenterazineCoelenteramide+O+CO+Light22萤光素酶:单体,36,000Daltons萤光素:(Coelenterazine)EnzymestructuresFireflyRenilla为什么要使用双报告基因报告基因A(首要信号)报告基
5、因B(第二信号)特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果比较首要与第二信号确定特异生物学反馈传统的双报告基因的缺点•细胞可能有内源脱乙酰基酶β-Gal或GUS活性.•CAT,β-Gal和GUS检测是终点检测.•不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或β-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速．双萤光素酶报告基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照的优点•速度–样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成•灵敏–两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低•方便–一管完成检测，样品不必分份用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）实验质粒萤火虫萤
6、光素酶对照质粒海肾萤光素酶用海肾萤光素酶作对照归一实验变化实验的(萤火虫萤光素酶)归一反应=对照的（海肾萤光素酶)数据处理举例第一天萤光素酶活性(RLU)比率归一的活性样品处理重复ＦＲ（F:R)变化倍数对照１5,1282,511２7,5533,815３10,5555,4137,7453,9131.981.00处理Ａ１5,13764,467２40,7123,574３88,7877,654Δ活性倍数6,02925,23211.525.82处理B(F/R)样品1587,6355,1442988,3478,832=F/R)对照3409,8813,564661,9545,847113.2157.1
7、8第二天对照１15,52920,4330.76第二天处理Ｃ计算如下：２21,89730,8410.71•10,76013,6200.7916,06221,6310.741.00处理Ｃ１850,23920,843Δ活性倍数２578,95114,830(791,021/19,154)３943,87321,788=（16,062/21,631)791,02119,15441,3055,81处理D114,86519,3-0528,96712
