树脂型PCR产物纯化和胶回收试剂盒

《树脂型PCR产物纯化和胶回收试剂盒》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、树脂型PCR产物纯化及胶回收试剂盒操作方法（一）从反应液中回收PCR产物1.将0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀）与50~100μl无石蜡油的PCR反应液颠倒混匀3分钟。然后装入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。2.加入500µl80%异丙醇（或乙醇），13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复第2步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇（或乙醇）除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇（或乙醇），13,000rpm再离心1分钟。3.将离心纯化柱套入干净的1.5

2、ml或2ml离心管中，开盖放置2~3分钟，使残留的乙醇充分挥发干净。加入50µlTE缓冲液（若用于测序，则加50µl超纯水）于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。4.离心管中的液体即是纯化的PCR产物，取4µl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并目测定量。-20℃保存备用。（二）从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液（50μl~

3、100μl反应体系）在1%的普通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的DNA条带装入2ml离心管中。尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶，这样可简化操作、提高回收量及DNA片段的质量。2.200mg~400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀），70℃保温5~10分钟，每两分钟颠倒混匀1次，使琼脂糖凝胶完全融化。对于高浓度的琼脂糖凝胶（>2%），每200mg的琼脂糖凝胶中加入0.5ml纯化树脂，加热融胶的时间延长到15分钟。1.将混和液转移入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。2.加入

4、500µl80%异丙醇（或乙醇），13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复第4步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇（或乙醇）除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇（或乙醇），13,000rpm再离心1分钟。3.将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，开盖放置2~3分钟，务必使乙醇充分挥发干净，加入40µlTE缓冲液（若用于测序，则加40µl超纯水）于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心

5、柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。4.离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取4µl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并目测定量。-20℃保存备用。常见问题及参考意见常见问题可能原因参考意见回收率低琼脂糖胶块未完全融化尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶400μl的纯化树脂中不要超过400mg琼脂糖凝胶增加温育时间至15分钟，每2分钟混匀一次琼脂糖凝胶浓度过高配制0.8%~1.0%的琼脂糖凝胶进行回收某些琼脂糖凝胶不容易被融化更换琼脂糖，情况可能会变好纯化树脂（于GS结合液中）有结晶出现将

6、纯化树脂（于GS结合液中）置于37℃温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在使用前要充分混匀洗脱温度过低加入无菌超纯水或TE浸透树脂后，于37℃温育2分钟回收片段过大或过小最适宜的回收片段为200bp~5Kb回收的DNA片段在后续实验中出现问题（例如连接失败）盐的浓度过高用80%乙醇漂洗回收产物增加漂洗次数残留有有机试剂增加离心时间，将80%乙醇或异丙醇去除干净EB染色须在紫外线下切胶，紫外线的照射损伤了DNA片段在长波紫外线下切胶尽量缩短切胶时间建议用其它DNA染料代替EB（例如GoodView™染料），在自然

7、光下切胶在胶里和电泳缓冲液中加入DNA紫外防护剂部分双链DNA变性为单链DNA在进行后续酶反应时，加入除酶以外的其它成份，通过95℃2分钟，再缓慢冷却至室温（25℃以下），使单链DNA重新退火为双链DNA，然后加入酶，继续进行酶反应用含有10mMNaCl的TrisBuffer洗脱DNA片段。（注意：盐的浓度可能影响后续实验）DNA片段易降解DNA在酸性环境中脱嘌呤用pH>7.0的无菌超纯水或TE洗脱；若非用于测序，最好用TE