实验二pcr扩增及其产物的纯化

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1、实验二PCR扩增实验三PCR产物的纯化实验目的和要求学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术.实验原理多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃

2、）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。PCR反应系统的组成引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳

3、仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂实验步骤PCR反应体系（每人３小管）模板DNA0.5ul(10ng)引物10.2ul(10uM)引物20.2ul(10uM)dNTPs1ul(1mM)TaqDNA聚合酶0.2ul(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)3ul去离子水25ul总反应体系30ul94℃变性5min后，开始以下循环：94℃变性反应40s55℃退火反应30s72℃延伸反应1min最后72℃反应2min3２个循环PCR反应条件PCR产物电泳检测PCR产物分析取5ulPCR产物，采用1％琼脂糖凝胶电

4、泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。学生PCR实验结果A.从PCR产物中直接回收纯化DNA(Promega公司)直接加100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μlPCR反应物；进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带；用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下

5、操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；将300μl(300mg)琼脂糖条带转移至1.5ml离心管。直接在65℃温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）；加等体积的溶液BE；下接C步骤。C.纯化步骤将PCR产物转移至一个1.5ml的离心管，向其中加入等体积溶液BD，混合均匀。将步骤1所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。12000rpm离心1min，弃滤液。此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上加入500μl溶液PE。1200

6、0rpm，离心1min，弃滤液。洗脱硅胶上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获取高质量的DNA片段加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中的液体。去除残留乙醇，避免乙醇影响后续酶促反应，同时也有利于DNA的充分溶解将离心柱置于新的1.5ml离心管。向纯化柱的中央处，悬空滴加15μl溶Ｅluent(60℃预热)，静置２min．12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段。贮存于-20℃备用。学生PCR实验结果(4l)PCR产物纯化后(

7、相当于0.8l原PCR产物）PCR纯化并酶切后(2l)3kb=62.5ng1kb=21.0ng作业分析并讨论PCR扩增结果与纯化后结果