珊瑚海绵共生放线菌的分离分类及初步鉴定

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1、珊瑚海绵共生放线菌的分离分类及初步鉴定由于海洋放线菌能够产生结构新颖、功能多样的次生代谢产物,成为新药来源的重要生物资源。生活在海洋生命极端环境中的海洋放线菌由于其独特的代谢途径以及产生新抗生素的能力，这不仅有助于其在极端环境中生存下来，也为我们提供了大量新颖的天然来源抗生素。因此，海洋环境将成为放线菌次生代谢产物的重要来源。20世纪30年代，ZoBell等发现海水具有杀菌的作用。随后，各国对海洋微生物资源的开发力度逐渐加大，但对其中生物资源的研究开发仍处于初级阶段。海洋放线菌广泛分布于海洋各种环境当中，海洋环境的的特殊性决定了海洋放线菌独特的代谢方式

2、和代谢产物。近年来研究人员不断从各种海洋环境中发掘能够产生具有新型作用机制的抗生素和抑制剂的放线菌。1材料与方法1.1材料海绵，珊瑚样品，2011年取自海南文昌与三亚西岛1.2分离培养基HV培养基：腐植酸1g，CaCO30.02g，Na2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl1.7g，复合维生素（核黄素0.5mg，硫胺素0.5mg，维生素B60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇0.5mg，泛酸0.5mg，生物素0.25mg，对-氨基苯甲酸0.25mg），蒸馏水500ml，陈海水500ml，琼脂20g，PH7.2SC淀粉酪素琼脂培养基：可溶性

3、淀粉10g，干酪素0.3g，KNO32g，NaCI2g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.05g，CaCO30.02g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水500ml，陈海水500ml，琼脂20g，PH7.0-7.4M2培养基：甘油6ml，精氨酸1g，K2HPO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCI20g，蒸馏水1L，琼脂20g，PH自然Raffinose-histidinemedium：raffinose10g，L-histidine1g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，K2HPO41g，蒸馏

4、水500ml，陈海水500ml，琼脂20g，PH7.0-7.4抑制剂：放线菌酮50mg/L，制霉菌素50mg/L，重铬酸钾50mg/L，萘啶酮酸20mg/L，1.3菌株平板纯化及活化培养基ISP2：酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，蒸馏水500ml，陈海水500ml，琼脂20g，PH7.31.4试验方法1.4.1分离方法称取海绵或珊瑚组织样品1g加入少许无菌海水，清洗两次，将样品转移至无菌研钵，加少量的无菌海水（10ml）研磨成浆液，再将浆液转入离心管，取1ml浆液稀释到10倍，100倍，每个稀释度分别取0.1ml稀释液涂布分离培养基，270C

5、培养1-4周，挑取明显分开的放线菌单菌落，在ISP2平板上划线纯化后，挑取单菌落于20%的甘油中-200C保藏。根据菌落形态，显微镜下菌丝及孢子特征进行初步鉴定。1.4.2菌株初步鉴定1.4.2.1菌株形态特征鉴定。接种分离出的菌株至燕麦培养基上，将灭菌的盖玻片斜插入平板，280C下培养，分别于7，14，21d观察记录培养基内菌丝，气生菌丝和可溶性色素的颜色变化，并将盖玻片取出，在光学显微镜下观察基内菌丝，气生菌丝的形态，用电子显微镜观察孢子丝及孢子的特征。1.4.2.2菌株的16SrRNA基因序列分析按照文献中的方法，用Chelex-100提取已分离

6、出菌株DNA，PCR扩增16SrRNA基因，PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。16SrRNA基因测序后，利用EzTaxon在线比对服务（http://www，eztaxon.org/）经行相关有效种的相似性搜索，确定菌种的属种，并下载相关菌种的16SrRNA基因序列，用Biotedit软件经行序列比对，随后用Mega4.0软件构建系统发育树。1.1.2试剂与仪器：Chelex-100由北京天根生化科技有限公司提供，PCR所用的2×EasyTaqPCRSuperMix由北京全式金生物科技有限公司提供。引物ITS-1：5′-TCCGTAG

7、GTGAACCTGCGG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′由北京全式金生物科技有限公司合成。PCR仪是PE-9600型PCR仪。电热恒温水浴锅是天津民利科学器材厂的YY91037-1999型恒温水浴锅。1.1.3培养基：土豆培养基（1L）：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然。1.2方法1.2.1菌体准备：用无菌接种环从固体培养基上挑取绿豆大小菌苔于无菌的1.5mLEppendorf管中，加入少量液氮，稍加研磨。1.2.2Chelex-100法提取基因组DNA：在装有研磨好的菌体的Eppendorf管中

8、加入0.5mL10%（w/v）的无菌Chelex-100溶液，在旋涡混合器上振荡5s，沸水浴1