大鼠足细胞的原代培养及鉴定

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1、大鼠足细胞的原代培养及鉴定贾苗，张益民，赖德源（中山大学孙逸仙纪念医院肾内科，广州510120）[摘要]目的建立一种重复性好、操作简便的大鼠足细胞培养方法。方法取重量200~220g的健康雌性SD大鼠，无菌取肾后通过差异过筛法分别通过80、150、200目细胞筛网，收集200目筛网上肾小球进行接种，利用植块法将接种培养面向上放置，4.5h后将培养瓶翻转过来正常放置于37℃、5%C02的恒温恒湿培养箱进行孵育。采用形态学观察和细胞间接免疫荧光技术，对足细胞进行鉴定，并用流式细胞仪进行足细胞纯度分析。结果5d后可见绝大部分

2、肾小球贴壁并有少许肾小球周围有细胞爬出，7~8d可见所有肾小球周围有大量细胞爬出，胰酶消化后传代培养。形态学及特异性抗体WT-1,nephrin鉴定为足细胞。流式细胞仪分析细胞纯度99%左右。结论3层筛网法分离大鼠肾小球，结合植块法促进肾小球贴壁，可以简单、高效地培养出原代足细胞，且具备足细胞生物学特性，且在操作简单的情况下细胞产量、纯度与国外文献报道的相当[关键词]足细胞；细胞原代培养；大鼠[中图法分类号]R322.61；R329.24[文献标识码]近年来随着对肾小球疾病发病机制的深入研究发现足细胞损伤是导致其持续进

3、展的关键细胞[1]，如微小病变肾病、局灶节段硬化肾病、膜性肾病和糖尿病肾病等。足细胞因为高度分化、结构复杂、定位特殊，体外培养的方法一直以来都受到国内外学者大量的关注并不断的被改善。随着转基因技术和免疫磁珠分离技术的使用，国外已有实验室成功建立了人[2]、鼠【3】的条件永久性足细胞株，但由于所要求的技术较高，花费较多，增加了普遍应用的难度，因此本文旨在建立一种简便可行、重复性好的大鼠肾小球足细胞的原代培养方法，为研究肾小球疾病的发病机制等提供一个实验平台。1材料与方法1.1实验动物清洁级SD大鼠，雌性，体重200~22

4、0g。购买自中山大学实验动物中心，实验动物质量合格证号：0051349，实验动物使用许可证：SCXK（粤）2004-0011。1.2主要仪器与试剂超净工作台，无菌手术室，高级荧光分析倒置显微镜，流式细胞仪，恒温细胞培养箱，80、150、200目不锈钢细胞筛网。DMEM/F12培养液、ITS、青-链霉素、FBS及胰酶-EDTA均购自GIBCO（美国）公司，PBS(吉诺，中国)，兔抗大鼠nephrin,WT-1多克隆抗体（Abcam,美国)，PI（碘化吡啶）和FITC标记山羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。1.3大鼠肾小球足

5、细胞原代培养1.3.1主要试剂的配制含有5%FBS的完全培养基500mL,内含有DMEM/F12培养液465mL，FBS25mL，ITS5mL，青-链霉素5mL，于超净工作台内配制。1.3.2大鼠肾小球的分离采用差异过筛法【4-6】分离肾小球，并进行适当改进：①于无菌动物实验手术室内脱颈处死大鼠后，固定在手术台上，消毒腹部皮肤后，沿腹部前[基金项目]广东省科技计划项目（2007B011000009）[通信作者]赖德源，电话：（020）81332487正中线与脐水平线做十字切口，充分暴露肾脏后，用剪刀剪下双侧肾脏，并迅速

6、放置于装有预冷DMEM/F12培养液的无菌离心管中，并放于冰盒内。将肾脏移入超净台中，去除肾脏外周脂肪组织，剥除完整肾包膜，用预冷的含有10%青-链霉素的PBS液冲洗3次。②从肾门处将肾脏沿纵形长轴剖为两半，可见红色颗粒样外观的皮质，用手术刀分离肾皮质后将其转移至80目细胞筛网中，剪碎成1~2mm3大小，用玻璃注射器针芯进行研磨至糜状，边研磨边用装有预冷的PBS的注射器进行冲洗，滴速要慢、轻，至糜状物颜色发白似纤维结缔组织，收集滤过液再通过150目筛网，用针芯在150目筛网上轻轻研磨并用PBS不断冲洗，最后将滤过液通过

7、200目筛网，收集200目筛网上的肾小球。上述超净台内的所有操作均在冰盒上进行。1.3.3肾小球的接种和培养将收集的肾小球离心5min,1500rpm,沉淀物中加入完全培养基2ml(2只大鼠)重悬，接种至3瓶75cm2培养瓶内，并每瓶加入10ml完全培养基，倒置培养瓶使接种面向上放入37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱内，孵育4.5h后将培养瓶翻转过来使其正常放置。1.3.4足细胞消化、传代：肾小球接种第5天,少量的内皮细胞已经观察不到，视野中为大量贴壁肾小球及从少数肾小球周围爬出的细胞，此时首次换液，之后继续培养，第7-

8、8d后，用0.25%胰酶-0.02%EDTA进行消化，将消化下来的产物通过200目筛网以去除肾小球，此时的肾小球主要包含系膜细胞，收集过滤液离心5min,1500rpm,完全培养基重悬，用血细胞计数板计数，按25cm2培养瓶：2.0×105/瓶，24孔板:3.0×104/孔的细胞密度接种，放入37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱内孵育