细菌生物被膜定性和定量研究方法

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1、细菌生物被膜定性和定量研究方法　　摘要：细菌生物被膜是浮游细菌和生物被膜细菌共同分布于同一生存空间内的特殊生长方式，能够逃避抗生素和机体免疫系统的清除而得以继续生存。对细菌生物被膜定性和定量方法进行了综述，比较和分析了其优缺点，旨在评价各种方法在生物被膜研究中的适用性。　　关键词：细菌生物被膜；浮游细菌；定性方法；定量方法　　中图分类号：Q939.1文献标识码：A文章编号：0439-8114（2016）09-2177-04　　细菌生物被膜是细菌将其自身包裹在其分泌物内形成的一种特殊复合体，具有不同于浮游细菌的

2、一些特殊性质，如生物被膜形成后造成细菌对外界环境的抵抗能力增强，在临床上形成对常用抗菌药物的耐受性，使得细菌性感染疾病迁延不愈和持续反复发作，给疾病治疗带来一定的难度。随着研究方法的发展和多学科研究领域的交叉和拓宽，近年来细菌生物被膜的定量和定性研究方法越来越完善，这些方法根据原理大致可分为三类：①基于生物被膜胞外基质和生物被膜内的总细胞数量（包括活细胞和死亡细胞）的定量试验：⑦基于活细胞的活菌计数试验：③7基于生物被膜胞外基质成分的定量试验。在相关研究中，研究者对生物被膜的结构、活性和细菌组成动态变化规律等

3、方面研究取得了很大的进展，尤其是无损伤的、原位的和在线的技术能够提供自动的、快速的和实时的信息，为生物被膜的研究提供了新的思路和方法。本文分析和比较了几种常用生物被膜定性和定量方法在生物被膜生物量研究中的优缺点，以期评价各方法在生物被膜研究中的适用性。　　1常用生物被膜定性研究方法　　生物被膜定性研究方法主要借助各种染色方法（如银染法）、光学和光谱学方法（如光学和电子显微镜技术等）进行生物被膜检查和监测，尤其是显微检查技术在观察选取生物被膜细菌群体的结构参数和构效关系方面具有明显的优势。在生物被膜定性研究中，

4、最常用的方法有以下几种。　　1.1快速银染法　　快速银染法主要用于细菌生物被膜的初步研究。其基本原理是通过快速银染法能够将细菌生物被膜中的多糖蛋白复合物染成灰褐色或灰黑色，通过银染能够初步判断不同培养阶段生物被膜中多糖蛋白复合物的动态变化规律，其操作步骤具体包括10个操作步骤：①基质材料表面浮游菌去除：②戊二醛固定；③蒸馏水漂洗；④氯化钙结合；⑤蒸馏水漂洗；⑥硝酸银染色；⑦对苯二酚显色；⑧蒸馏水漂洗：⑨硫代硫酸钠固定：⑩蒸馏水漂洗。　　1.2玻璃试管法　　其原理是根据气-液界面形成染色环状物的颜色深浅来判定细

5、菌生物被膜的形成能力。常用的染料有结晶紫和刚果红等，由于该方法存在一定的主观误差，因此主要用于生物被膜形成能力的初步筛选。　　1.3基于电子显微镜的定性方法7　　借助原子力显微镜、透射扫描电镜和激光聚焦显微镜等对细菌生物被膜进行观察，能够对生物被膜的立体结构进行定性分析。尤其是相关染料与激光共聚焦显微镜相结合，能够实现对生物被膜中细菌生理状态的定性和定量分析。相关电子显微镜定性研究方法的缺点是实验条件要求较高，实验设备较贵重，因此不常用于常规检测和研究。随着电子显微镜技术的发展，近年来，在实际的科研中。电子显

6、微镜相关技术常与染色技术和分子生物学技术结合，广泛应用于细菌生物被膜的定性和定量研究。　　2生物被膜定量研究方法　　2.1琼脂平板菌落计数法　　琼脂平板计数法是一种最基本的菌落计数法，在实际的实验操作过程中不仅劳动强度大，而且费时，同时误差较大，不适宜大样本观察。虽然可以通过多次计数求平均值的方法来减小实验误差，然而这样无疑会增大工作量和强度，因此在实际实验中很少单独采用，常常结合其他方法对细菌生物量进行定量研究。在生物被膜细菌计数过程中，需要辅助手段将生物被膜中的细菌游离，辅助手段对被膜细菌的影响也制约着琼

7、脂平板菌落计数法的重复性。　　2.2结晶紫（CV）染色法　　结晶紫是一种碱性染料，能够结合生物被膜表面带负电荷的表面分子和胞外基质中的多糖成分，通过测定吸光度来对细菌生物被膜形成能力进行鉴定和分型。由于生物被膜中的胞外基质成分和细菌本身（包括活细胞和死亡细胞）均能被结晶紫染色，因此改良结晶紫方法尤其不适合用于对抗菌药物或者其他化学物质对生物被膜内细菌杀伤效果的评价。在研究中常用来对细菌生物被膜下次形成能力进行初步筛选和鉴定。7　　1985年Christensen等首次采用结晶紫染色方法对非黏液性链球菌生物被膜

8、进行了定量分析，2000年，Stepanovic等对结晶紫方法进行改进，增加了结晶紫染色方法对细菌生物被膜定量的准确性，其能够对微孔板生物被膜生物量进行较为全面的量化。然而，结晶紫染色方法在铜绿假单胞杆菌生物被膜定量中具有较大的批内和批间误差，其原因可能与铜绿假单胞杆菌含有较多的水通道导致其生物被膜固定不充分有关。　　2.3Syt09/PI染色法　　Syto9是一种能够对核酸进行染色的荧光染料.能够