【硕士论文】热处理肿瘤疫苗联合佐剂CpGODN诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究.pdf

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1、博十学位论文中文摘要中文摘要第一章不同热剂量热疗对小鼠黑色素瘤细胞HSP70表达的影响目的：热疗可以增强肿瘤细胞的免疫原性以制备肿瘤疫苗，且这种免疫原性的增强与HSP70的诱导表达相关。然而不同温度的热诱导对细胞表面抗原的影响不同，且这种影响在很大程度上取决于肿瘤的类型、动物模型(小鼠或者大鼠)、热剂量以及热作用后恢复的时间。为了获得增强小鼠黑色素瘤B16细胞免疫原性的最适温度，本实验比较了不同热剂量热疗对B16细胞HSP70表达和转录的影响，为下一步制备小鼠黑色素瘤疫苗提供了实验基础和依据。方法：体外培养B16细胞

2、至对数生长期，将培养瓶密封浸没于恒温水浴槽内以42℃60min，45℃15min以及50℃5min热疗。热疗后予以换液并放回37"C细胞培养箱进行复温孵育，分别于复温孵育2h，12h，24h，48h后收集细胞的总RNA和总蛋白，采用RT-PCR法和Westernblot法从基因转录和蛋白表达水平检测不同温度热疗后HSP70的表达情况以探讨B16细胞免疫原性与热剂量(42．50℃温度范围)及复温孵育时间的相关性。结果：Westernblot结果显示与37℃对照组相比，热疗各组均能诱导HSP70明显表达(p

3、但各组表达高峰时间点不一致。42℃组在2h时达表达高峰，随后逐渐下降；45。C组则在2h时表达尚无明显表达增高，随后逐渐升高，至24h达高峰后开始下降，且该高峰表达量与42℃高峰相比增高更显著(p

4、以及50℃热疗对小鼠黑色素瘤细胞B16HSP70表达的影响，提示45。C15min热疗可能是制备富含HSP70细胞瘤苗的理想热剂量，为下一步制备肿瘤疫苗的热剂量选择提供了依据。关键词：热疗，黑色素瘤，热休克蛋白70，免疫原性第二章热处理肿瘤细胞裂解物联合免疫佐剂CpG．ODN诱导特异性抗肿瘤免疫反应的实验研究目的：越来越多的证据表明热疗及其相关的热休克反应可以增加肿瘤细胞的免疫原性，能启动并促进免疫，因而有可能是制备和改良肿瘤疫苗的途径之一。这种热处理瘤苗(高温固化瘤苗、热休克诱导后细胞的裂解产物等)如应用于小鼠体内

5、，无论是预防接种还是治疗荷瘤，均显示出了一定的抗肿瘤效应。但由于肿瘤细胞存在各种逃逸机制，单一瘤苗的疗效常不理想。CpG寡聚核苷酸(CpGODN)具有提高蛋白抗原和DNA疫苗的免疫原性，可作为多种抗原的免疫佐剂而发挥独特的免疫增强作用，在粘膜免疫、提高新生动物免疫力和抗肿瘤等方面都显示出巨大的潜力。基于以上观点，本研究以小鼠黑色瘤为模型探索利用45℃热诱导后B16细胞裂解物作为瘤苗，联合新型免疫佐剂CpG．ODN免疫小鼠，观察其诱导的小鼠抗肿瘤免疫保护作用及其对小鼠免疫系统功能的影响。方法：48只C57BL／6小鼠随

6、机分为4组，每组12只：PBS对照U博士学位论文中文摘要组(PBS)、45℃热处理肿瘤细胞裂解产物治疗组(Heatedcelllysates，HCL)、CpG．ODN2395治疗组(CpG)和CpG．ODN2395+45。C热处理肿瘤细胞裂解产物联合治疗组(CpG+HCL)，并于第0、6、12、18、24天将四种疫苗：PBS、HCL(2x107个细胞裂解产物／0．2ml／只)、CpG-ODN2395(30Irtg／0．2ml／只)和HCL+CpG((HCL(2x107)+CpG(30I-tg))／0．2ml／只)分四

7、点分别注射至各组小鼠双侧腋窝、双侧腹股沟皮下，0．05mL／注射点，共0．2mL／只。每隔5天一次，共接种5次。第30天每组随机抽取3只小鼠，收集小鼠脾细胞和外周血检测小鼠脾细胞特异性增殖、CTL细胞细胞毒活性、Thl型细胞因子(IFN_丫、IL．2)的分泌活性以及小鼠外周血T细胞亚群CD4+、CD8+的比值，及CD4+CD25+调节性T细胞亚群百分比。另于第30天以1×105个活性B16细胞对剩余小鼠进行肿瘤攻击，观察各组小鼠的出瘤率、出瘤时间，肿瘤生长状态以及生存期以评估肿瘤疫苗对小鼠恶性黑色素瘤的保护性免疫作用

8、。结果：与PBS相比，CpG．ODN2395，HCL以及联合疫苗(HCL+CpG．ODN)均可明显抑制小鼠肿瘤生长(p