白藜芦醇诱导hepg2细胞凋亡的线粒体机制

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1、博士学位论文白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的线粒体机制博士研究生：马晓冬指导教师：王惹君教授摘要研究背景和目的白藜芦醇(Rcsve删叻l，3,4，5，．三羟基．反．均二苯代乙烯)是广泛存在于植物中的一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护心血管、抗肿瘤等作用。近年来的研究表明：白藜芦醇对多种肿瘤细胞具有诱导凋亡的作用并对凋亡过程中的多个环节发挥作用，如：抑制iNOS表达，抑制细胞色素P450IAI的转录，PKC磷酸化；直接以剂量和时间依赖方式阻断肿瘤坏死因子TNF诱导的核转录因子NF-kap!paB的

2、活化；由细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK)和p38激酶使p53蛋白第15位上的丝氨酸酸化而诱导的p53的活化和凋亡等。但迄今为止，对其抗癌作用及其诱导细胞凋亡的分子机制还有许多有待揭示之处，尤其是对肝癌的作用。线粒体曾一度被认为是细胞的“能量工厂”，其主要功能是为细胞提供各种功能活动所需要的能量。除此以外，近年来人们认识到线粒体还具有其他一些重要的功能，其中线粒体在细胞凋亡中的关键作用已成为研究热点。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关，包括casp蹴激活因子的释放，如细胞色素C(cytochromec

3、，CyLc)、电子传递链的改变、线粒体膜电位(△‰)的丧失、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。不同信号的传导最终都集中到线粒体上来启动或抑制这些事件及其效应的产生。研究发现，凋亡早期线粒体结构保持完整，而坏死细胞的线粒体则发生肿胀，因此将其作为凋亡与坏死的一个重要区别。线粒体的结构和功能的改变，能加速核凋亡特征的出现，是细胞凋亡进程中关键的一步。越来越多的证据表中文摘要明，线粒体在细胞凋亡中起最基本的作用。现在人们普遍认为，线粒体是凋亡的执行者。鉴于以上研究，本文目的在于认识白藜芦醇

4、诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的机制，从分子水平上了解线粒体在白藜芦醇诱导细胞凋亡中的作用机制。此外，实验初步分析鉴定了白藜芦醇处理前后HepG2细胞线粒体差异蛋白，探求白藜芦醇影响线粒体的具体分子机制，为白藜芦醇防治肝癌提供更广泛、系统的实验依据。研究方法本研究以人肝癌细胞系HepG2为研究对象，采用MTT和流式细胞技术观察不同浓度的白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用及其对细胞生长周期的影响。通过AnnexinV-FITC／PI双标记及流式细胞技术检测细胞的凋亡率；电子显微镜观察凋亡细胞的形态变化；用rhodam

5、inel23(Rhl23)和tetramethylrhodamineethylester(TMRE)标记细胞AUg。，并分别通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测白藜芦酵对△_甲。的影响。使用calcein和TMRE荧光双标记技术结合共聚焦显微镜检测了白藜芦醇对完整细胞内线粒体通透转变孔道(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)的影响，并使用流式细胞技术检测了c”．c的释放，进一步证实了白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的线粒体通路。为进一步观察白藜芦醇诱导MPTP开

6、放的机制，采用共聚焦显微镜观察白藜芦醇对细胞内钙离子的影响，并建立了细胞的通透性模型，观察钙离子在白藜芦醇诱导MPTP开放中的作用，分析研究了白藜芦醇诱导MPTP开放、cyt．c释放和钙诱导线粒体钙释放之间的关系。本实验综合的分析研究了白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的线粒体通路及其诱导MPTP开放的作用机制。此外，采用双向电泳和质谱技术分析鉴定了白藜芦醇处理前后HepG2细胞线粒体差异蛋白。n博士学位论文实验结果一、白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用1．白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制实验结果表明经白

7、藜芦醇处理的HepG2细胞的增殖活性明显弱于未处理组的HepG2细胞(P

8、荧光显微镜观察结果显示：细胞体积缩小，染色质浓缩，细胞核呈折叠样，部分细胞核裂解为碎块．AnnexinV-FITC／PI双标记结合流式细胞仪分析显示：HepG2细胞经白藜芦醇处理后，凋亡细胞和坏死细胞的总和明显多于对照组凋亡细胞和坏死细胞的总和。实验结果表明白藜芦醇可以诱导HepG2细胞凋亡，并随浓度的增大而增多。二、白藜芦醇对AT。、MPTP