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1、白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制作者：朱青，张王刚，王立锋，王芳，杨安钢【关键词】白藜芦醇Resveratrolinducedapoptosisandcellarrestincancercells 【Abstract】AIM:TostudythemechanismofresveratrolinducedHepG2andK562cellsapoptosisandcellarrest.METHODS:CellmorphologicalmethodandAnnexinVtechnologyetry(FCM)edicinesensitivityofHepG2an
2、dK562cells.RESULTS:ApoptosisanlivercancerHepG2celltreatedatinecondensationandfragmentationentationeanddosedependenteffectsofresveratroltoHepG2cellentofhumanlivercancereanddosedependenteffect.Theresveratrolinducedcellapoptosisisspecifictocancercells. 【Keya公司,溶于二甲基亚砜（DMSO,购于Sigma公司）,浓度稀释为5×
3、106mol/L,-20℃备用.RPMI1640和新生牛血清购自Invitrogen公司.MTT购于华美生物工程公司，溶于1×PBS（10mmol/L,pH7.4）使浓度为5g/L，0.22μm的微孔过滤除菌后4℃备用.DNA荧光染料(PI和AnnexinV)购于Coulter公司，4℃备用. 1.2方法 1.2.1细胞培养人肝癌1×105HepG2和慢粒K562细胞培养于含100mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液中，加入1×105ｕ/L青霉素,100mg/L链霉素,置于孵箱，在37℃,50mL/LCO2饱和湿度的条件下培养，实验时取对数生长期细胞. 1.2.
4、2形态学观察以5,10,20,50和100μmol/LRES作用细胞，24~72h后免疫相差倒置显微镜下观察HepG2和K562细胞形态变化情况. 1.2.3AnnexinV荧光染色检测细胞凋亡收集1×106细胞(HepG2细胞在收集前已用AnnexinV5μL37℃孵育10min),PBS洗2遍，800～1000r/min离心5min，弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞，加入5μLPI和5μLAnnexinV于细胞悬液中（每份样品均设立凋亡细胞阴性对照和阳性对照,以调整样品检测的最佳工作电压和双色荧光补偿）,轻轻混匀后4℃避光染色10min，流式细胞术（FCM)分析.
5、 1.2.4FCM检测细胞周期收集1×106细胞,PBS洗2遍，800~1000r/min离心5min，弃上清，加入1mL生理盐水制成单细胞悬液.加入预冷的无水乙醇2mL快速混匀，固定细胞.弃固定液，PBS洗2遍，1000r/min离心5min，加入1mLDNA荧光染料PI，4℃避光染色15min，FCM分析. 1.2.5四唑蓝比色法（MTT）检测RES对细胞生长的影响收集细胞，将细胞重新接种至96孔板中，使其每孔细胞数为1×103~1×104个，分别以20,50和100μmol/LRES作用细胞，加入100mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液培养.于加药后24,
6、48和72h进行检测.每孔加入MTT溶液20μL,37℃继续培养4h后弃上清，每孔加入150μLDMSO溶解样品,用酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光度值，计算均值，绘制生长曲线. 2结果 2.1RES作用后肿瘤细胞形态的变化经RES5～100μmol/L作用后，免疫相差倒置显微镜下可见HepG2细胞典型凋亡细胞形态学特征：细胞体积缩小，胞质浓缩，胞核固定，染色体凝集，有的形成凋亡小体.随作用时间延长可见坏死细胞增多，表现为细胞肿胀，破碎（Fig1，2）.但K562细胞无明显变化. 2.2RES对细胞周期的作用RES作用于K562细胞和HepG2细胞48h时，FCM
7、检测细胞周期虽无明显细胞周期G1期前subG1峰，但K562细胞G1期细胞数占检测细胞的百分比为50.72%,G2期为22.81%,凋亡率为0.59%；HepG2细胞G1期为67.75%,G2期为13.69%,凋亡率为9.97%.由此检测到RES作用后HepG2细胞周期明显被阻止于G1期. 2.3RES作用后肿瘤细胞的凋亡不同浓度的RES对K562细胞凋亡无明显作用，而对HepG2细胞凋亡作用较为明显，凋亡与坏死共存.随着时间的延长坏死逐渐增多.AnnexinV荧光染色检测HepG2细胞凋亡率最高为13.7%（F
