鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽基因原核表达的-研究

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1、黑龙江大学硕士学位论文间内抑制破骨细胞的活性，在长时间内则能抑制破骨细胞的增生，从而减少其数量，达到抑制骨吸收，降低骨转换的目的【201。目前认为，降钙素对破骨细胞的作用是借助子破骨细胞膜上的降钙素受体，其基因的多态性与骨密度有关‘2¨。③调节钙磷水平。降钙素能抑制肾脏对钙、磷的重吸收，增加钙、磷排泄，降低血钙，还可以增加钠和氯的排泄。另外，低剂量的降钙素还可以抑制肠钙的吸收‘201。④止痛。研究发现，在大脑调节痛觉的区域中，降钙素的结合位点不同于降钙素基因相关肽的结合位点，因此，降钙素可能直接调节中枢神经系统(CNS)的痛觉[221。另外，降钙素可以改变神经元的钙

2、离子流，作用在特异的中枢神经系统的疼痛受体上，抑制疼痛，刺激垂体对p。内啡肽的释放，阻断痛觉的传导和对脑下丘体的影响，直接调节中枢神经系统的受伤害感受作用口31。降钙素可以增加促肾上腺激素的分泌，也能调节前列腺素的代谢，具有外周止痛的作用f20l。并且，研究发现，降钙素对于骨质疏松性骨折或骨骼变形所引起的慢性疼痛以及骨肿瘤等疾病引起的骨痛均具有减轻疼痛的效果刚。由于降钙素能抑制胃酸分泌，便可用来治疗急性胃溃疡；降钙素能抑制胰腺激素的分泌及抑制酶的释放，还可用于治疗急性胰腺炎；同时，降钙素对甲状旁腺机能的亢进也有治疗作用1251。此外，降钙素也可能引发一些不良反应，常

3、见恶心、呕吐、头晕，偶见多尿、寒战【20l，因此，在使用时需要注意调节降钙素的使用剂量。1．1．4降钙素的研究现状关于降钙素的研究，早在20世纪70年代就已经开始利用固相和液相法进行合成降钙素，但是其合成步骤多，纯度差，获得率低，因此价格十分昂贵。在80年代，国外开展了利用基因工程法生产降钙素的研究。应用基因工程法可以相对比较容易地准备出所设计的新型降钙素，以期获得活性高，半衰期长，无抗原性的新型降钙素以供临床使用1261。有关降钙素基因表达及其表达宿主的研究，刘颖等㈣已经利用昆虫杆状病毒系统表达重组鲑鱼降钙素(RecombinantSalmonCalcitonin

4、，rsCT)，探索了一条真第1章绪论核生物表达重组鲑鱼降钙素的新途径。Myake及Tajima等也分别报道了利用基因工程法生产降钙素的研剜28291。Ishikawa应用串联法表达人的降钙素‘301。目前，关于降钙素融合蛋白的表达一般采用将降钙素与一个大的载体相连接，形成融合蛋白或是进行分泌表达p¨。目前，国内有报道把鲑鱼降钙素(SalmonCalcitonin，sCT)基因与载体串联，并在TOPl0中表达串联多拷贝基因，既不会使表达产物降解，又不会引起在进行与大分子蛋白融合表达时，因目的产物只占表达产物的一小部分而使产率下降的问题【261。影响外源蛋白表达的因素有

5、很多，其中，在诱导表达时保证细菌旺盛的生长状态是很重要的，另外，保证在大肠杆菌代谢过程中产生的有害物质(主要是乙酸)的较低含量也不容忽视【32J。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，人们常利用金属螯合层析技术【3习对目的蛋白进行分离纯化，该技术就是在目的蛋白序列中添加一段短肽序列作为标签，该标签含有6个组氨酸，即组氨酸标签，使其具有与金属离子螯合的共同性质。由于组氨酸标签序列很短，对目的蛋白的性质影响较小，因此，所得到的目的蛋白可以直接用于蛋白的功能研究或进行抗体的制备1261。另外，还可以根据融合蛋白中配体蛋白的性质来设计亲和层析介质，利用亲和层析的方法来达到分

6、离该融合蛋白的目的【34,351。常用的pGEX表达载体中的配体蛋白是谷胱甘肽转移酶，利用其底物谷胱甘肽固定于树脂上，可以作为亲和层析法分离纯化融合蛋白的介质【36】。美国PharmaGenetics公司应用基因工程法生产鲑鱼降钙素，用pGEX质粒作为表达载体，将降钙素分子与谷胱甘肽转移酶(GST)蛋白进行融合表达。融合蛋白用G—Sepharose，4B柱进行亲和层析纯化，BrCN裂解融合蛋白，再用u．AE酶使C一末端产生脯氨酰胺，利用HPLC纯化得到降钙素，收率可以达到85％以上【371。目前，国内也已有人用Thiobind亲和树脂进行纯化表达的融合蛋白，融合蛋白

7、的纯度达到90％12叫。另外，PharmaGenetics公司还成功构建了a．AE的表达质粒，Gt．AE酶的使用将加速利用基因工程法生产降钙素的进程p引。此外，越来越多的研究显示，降钙素的组织发生、细胞生长、分化及生存方面也发挥着重要的作用。随着分子生物学技术的不断进步，关于降钙素相耦联的细胞内信号传导的研究亦在不断的扩展和深入Il引。目前降钙素的临床引用还很局黑龙江大学硕士学位论文限，主要用于治疗骨质疏松、Paget’S病及肿瘤性的高血钙症，其中关于降钙素抑制骨吸收及镇痛的作用已经明确，在原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症的治疗中已经得到了广泛的认同，但是，国