真鲷脂肪酶基因扩增及同源重组载体构建

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1、真鲷脂肪酶基因的扩增及同源重组载体的构建摘要本文通过对中国海产名贵经济鱼类真鲷(Pagrus埘ajor)基因组DNA的扩增，分别得到脂肪酶基因的4kb和1．2kb两个片段。首先对DNA提取的起始材料及分离方法进行了实验分析，得到了纯度较高的DNA。随后对PCR反应条件进行了分析，得到清晰的目的条带。最后选用A—T克隆和粘端连接两种方法分别获得了4kb和1．2kb两个片段的克隆，通过测序分析验证两个片段序列的正确性，保证了下一步基因转移工作的顺利进行。采用正负选择法进行脂肪酶基因的同源重组载体的构建，通过常规分子克隆实验方法在4kb和1．2kb之间插入了neo正选

2、择基因，在4kb片段的3’末端插入了svtk负选择基因，最终完成了真鲷脂肪酶基因的同源重组载体的构建工作。通过磷酸钙共沉淀法对传代30代的真鲷胚胎干细胞进行基因转移，使用G418正选择和GANC负选择两种培养基对发生同源重组的细胞进行筛选。(以转染的经基本培养基培养的Es细胞为对照组，观察第一实验组未经转染的但经G418培养基筛选的Es细胞结果几乎全部死亡，第二实验组转染后的经G418培养基筛选的ES细胞结果部分存活，第三实验组转染后经G418和GANC两种培养基筛选的ES细胞结果大部分死亡。r这一实验结果说明基因打靶载体完全可以用于大型经济鱼类的基因敲除工作，

3、neo基因和GANC基因对发生同源重组的ES细胞产生了有效的富集作用。为海产经济鱼类的功能基因分析和基因定点突变育种研究奠定了基础。关键词：真鲷，脂肪酶基因，PCR扩增，正负选择，基因打靶载体，胚胎干细胞AmpIificatiorlofpagrUSmajor＼ipasefragmentandconstruotionofhomoIogousrecombinatiORvectorAbstractPositive—negativeselectiongenetargetingvectorhasbeenwidelyusedingeneknock—outexperiment

4、．OMrresearchmainJyfocusesonthePagrusmajorLipaseknock—outwiththisselectivestrategy．Uptonow,wehaveamplifieda4kblipaselongfragmentanda1．2kblipaseshortfragmentseparatelywithPCRmethod．EScellgenomeDNAiSusedasPCRtemplate，ByDNAsequencinganalysis，thetwolipasefragmentshavebeenverifiedtobevalid

5、forgenetargeting．Throughordinarygenecloningtechniques，thepositiveselectivegeneneogeneandnegativeselectivegeneGANCgeneareinsertedintothelipasehomologousvector,neogeneiSlocatedinthemiddleoftwofragments，whileG爿ⅣCgeneiSlocatedatthe3、endof4kbfragment．Thusapositive-negativeselectionvectorf

6、orPagrusmaforLipaseknock．outhasbeenconstructedsuccessfully．Furthermore，wevalidatetheusabilityofthevector．ThetraditionalcalciumphosphateCO．transfectioniSusedforlinearizedgenetotransferintoEScells．ThenG418andGANCselectiveculturesareusedfortheselectionofhomologousrecombinationcellsfromw

7、holecells．Thewholeprocesshaspassedfor2weeks．IncontrasttothecontrolgroupthatiStransfectedbutwithordinaryculture．thefirstgroupwithouttrailsfectionbuttreatedwithG418culturealmostdiesout．thesecondwithtransfectionandtreatedwithG418culturehaspartlysurvived，thethirdgrcupwithtransfectionandt

8、reatedwithG4