重组载体质粒扩增流程

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1、重组载体质粒扩增的实验步骤：Ⅰ、感受态细菌的制备（CaCl2化学转化法）准备：LB液体培养基、LB固体平板（含抗生素和未含抗生素）、0.1mol/L氯化钙溶液（预冷）、细菌冻存液（0.1Mol/LCaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌（stbl3）挑取一点（枪头沾取一点）加入盛有1mlLB液体培养基的15ml离心管中；37℃，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏)。2、取10μl以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养（纯化）。3、挑取20多个前一天培

2、养的细菌菌落加入3mlLB液体培养基里37℃，220rpm，摇菌培养12个小时（扩增，需使细菌老化，因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期）。4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300mlLB培养基中，在37℃220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时（使细菌处于对数生长期，易于转化，可每半小时测一下OD600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。以下步骤开始注意无菌操作：6．将所有培养好的菌液分装移至离心管中，在冰上冷却10分钟；7．4℃下3000g冷冻离心10分钟；8．弃去上清，加入30ml预冷0.1Mol/LCa

3、Cl2溶液，轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；9．4℃下3000g冷冻离心10分钟；10．弃去上清，加入5ml预冷0.1Mol/LCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细菌重新悬浮；11．4℃下3000g冷冻离心10分钟；12.弃去上清，加6ml0.1Mol/LCaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后，分装成100μl或200ul/EP管（4℃预冷），-80℃冷冻贮存备用。【练手实验中扩增摇菌时中途摇床关闭了一段时间（具体不详），后续接着摇菌过夜。离心时用的6000rpm，第二次离心时很

4、快溶解，遂进行了第三次离心获取沉淀。配制冻存液忽视了甘油对氯化钙的稀释，用1.8ml50%的甘油加入4.2ml0.1mol/L的氯化钙，即氯化钙的浓度没有达到0.1mol/L。分装时每个EP管含有300μl的感受态细菌。】Ⅱ、重组载体质粒转化细菌及转化成功细菌（即转化子）的筛选准备：含筛选抗生素的固体培养基、冰、42℃水浴锅、37℃预热的培养基1、取100μl感受态细菌在冰上解冻，每管加质粒载体（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻弹以混匀内容物，在冰中放置30min。2、将EP管放到预加温到42℃的循环水浴中的浮板上，放

5、置90s～2min，不要摇动EP管。3、快速将EP管转移到冰浴上中，使细菌冷却1～2min4、每离心管加400μlLB培养基，事先用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min至1H使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。5、将适当体积（10μl??）已转化的感受态细菌涂布到含相应抗生素抗性（100μg/ml的终浓度）的LB固体培养基上旋转均匀涂布直至有发涩的感觉，即使平板干燥，然后倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落（或者将质粒涂布均匀后在37℃孵箱里先正放培养30min左右，

6、再倒放培养）。【练手实验中转化VSVG质粒的平板长了2个菌落，而Δ8.2质粒的平板貌似没有菌落形成。分析原因排除了平板氨苄青霉素浓度（100μg/ml）太高,可能有两个原因：1、复苏的细菌浓度低，操作时将100μl感受态细菌加入了800μl的培养基摇菌，并且只摇菌40min；2、涂板时量太少，只加了20μl的复苏菌涂布。总的来说可能种在平板上的细菌太少。】Ⅲ、转化细菌的扩增：准备：LB培养基1、挑取以上培养的转化细菌的单菌落（1至数个）于2.5ml有氨苄抗生素的LB液体培养基里37℃220rpm摇菌12H（扩增细菌）2、将上

7、一步摇的2.5ml细菌加入250ml抗性LB液体培养基（氨苄青霉素）里，37℃220rpm摇菌24H（扩增质粒）注：扩增的质粒不能立即提取时可将所有菌液转移至离心瓶里6000rpm离心收集细菌沉淀，然后-20℃保存。【此次提质粒的细菌连同LB培养基一起冻存了，应把离心弃去培养基后仅冻存沉淀】Ⅳ、重组载体质粒提取及纯化（《详见试剂盒质粒提取步骤》）1用15ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清。●根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。2加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，漩涡

8、剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。3加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。●此步骤不宜超过5min。4加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。