胶质芽孢杆菌质粒稳定性及其生物学特性

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1、浙江理‘T大学硕士学位论文摘要胶质芽孢杆菌因具有溶钾解磷固氮等多种功能，已广泛应用于农业生产，在冶金、陶瓷、废水处理等领域也显示了广阔的应用前景。迄今，有关胶质芽孢杆菌分子机制研究一直较薄弱，导致高效菌株的筛选和优化缺乏有效的筛选标记，功能调控与工程菌的构建和分子改造也缺乏理论依据，严重制约了菌种性能的提高及其应用。本论文探讨了胶质芽孢杆菌质粒的稳定性及生物学特性，并初步探索了质粒的功能，为其分子机制研究奠定初步基础。首先，在确定胶质芽孢杆菌质粒提取方法的基础上，检测了20株胶质芽孢杆菌的质粒。以麦芽糖为碳源，添JJll2％o(NH4

2、)2S04，在Aleksandrov培养基中培养14"--16h的菌体，用四种方法一碱裂解法、改进Kronstael法、SDS法、试剂盒分别提取胶质芽孢杆菌质粒，结果试剂盒和SDS法适于胶质芽孢杆菌质粒的提取，其中试剂盒法提取的质粒纯度较高，适用于后续分子生物学实验，SDS法稳定性好，适用于质粒检测。采用SDS法检测20株胶质芽孢杆菌的质粒，发现16个菌株含有约7000bp的质粒pBMl，其中菌株BM2另含有一个约6000bp的质粒pBM2。酶切图谱分析表明，质粒pBMl和pBM2均可被BamHI、妇I、HindIII和EcoRV等酶

3、切，酶切位点为1,---,2个。可见，胶质芽孢杆菌中普遍存在环状质粒pBMl。荧光扫描法粗略测定了胶质芽孢杆菌BM2质粒的拷贝数，结果质粒pBMl(7kb)的平均拷贝数为11，质粒pBM2(6kb)的平均拷贝数为10，表明菌株BM2的质粒为低拷贝质粒。胶质芽孢杆菌稳定性较差是影响其应用的一个重要因素。以菌株BM2和BM4为材料，考察了胶质芽孢杆菌质粒在各种条件下的稳定性，结果胶质芽孢杆菌质粒在不同营养(碳源、氮源)、培养条件(温度、盐度)及连续转接过程中都较稳定。30,-,．-,37"(2培养，菌株BM2和BM4的质粒保持稳定；40℃

4、培养，质粒稳定性显著降低；菌株BM2耐盐性差(<1％NaCI)，0．1"--0．6％NaCl对菌株BM2的质粒无影响；氮源、碳源对菌株BM2和BM4生长及其质粒没有影响；传代对菌株BM2或BM4的生长及质粒均无影响，连续转接30次后，菌株固氮、溶磷解钾活性在转接前后无差别。可见，胶质芽孢杆菌的质粒具有较高的稳定性。采用SDS一高温法和吖啶橙法分别对胶质芽孢杆菌BM2进行质粒消除。37℃高温结合不同浓度SDS处理菌株BM2，0"--0．002％SDS抑制菌株生长，其致死浓度为0．0025％；SDS处理后，菌株BM2的菌落直径比对照大。吖

5、啶橙处理，显著抑制菌株生长；200p,g．ml。1处理48h，致死率100％。但两种处理均不能将质粒pBMl和pBM2消除，表明这两种方法不适用于胶质芽孢杆菌的质粒消除。比较含质粒菌株7519、BM2和无质粒菌株1．3714、SBVll浙江理工大学硕士学位论文的生长、固氮、溶磷解钾活性，结果发现含质粒菌株的生长情况、固氮活性及溶磷解钾活性均高于无质粒菌株，表明质粒与固氮、溶磷解钾活性具有一定的相关性，但该质粒的确切功能有待于进一步研究。关键词：胶质芽孢杆菌；质粒；稳定性；特征VnI浙江理工大学硕士学位论文AbstractWiththe

6、abilitiesofdissolvingphosphate(P)andpotassium(K)andnitrogen—fixing，Bacillusmucilaginosushasbeenappliedwidelyasabiologicalfertilizerinagricultureandasapotentialagentinmineral，ceramicengineering，waste-waterpurification．However,theknowlessnessofmolecularmechanismhasgreatly

7、preventedthebroaderuseofBacillusmucilaginosus．ThisstudyinvestigatesthestabilityoftheBacillusmucilaginosusplasmidsandtheirbiologicalcharacteristics，itmayhelpUStoknowaboutthemolecularmeehanism．First,theproperplasmid-extractingmethodwaschosenandtheplasmidsof20Bacillusmucil

8、aginosuswerechecked．Culturedfor146--16hintheAleksandrovmediumwithmaltoseand2‰(NH4)2S04，strainsofBacillusmucila