光合细菌产类胡萝卜素的研究

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：—粒日期：掣关于学位论文使用授权的声明’本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采

2、用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：导师签名：期：三兰f1{山东大学硕士论文摘要类胡萝卜素作为一_种天然色素是生物体必不可少的组成成分。兜合细菌中富含大量的类胡萝h素，而且提取容易，适于大量生产．因此研究不同光合细菌中的类胡萝卜素组成，以及利用光合细菌来生产各种类胡萝卜素，具有深远的意义。本论文对光合细菌产番茄红素等类胡萝h素的提取及产量的优化进行了研究，并着重对固氮红细菌(Rhodobacterazotoformans)的色素合成途径进行了分析，同时对累积链孢红素的突变抹的突变

3、基因作了初步的研究。在光合细菌类胡萝}素的提取方面，通过对萃取溶剂、菌体破碎液与萃取剂的萃取比例以及萃取时问的摸索，总结出了一个快速高效提取光合细菌类胡萝卜素的方法，采用乙酸乙酯作为萃取溶剂，按照l：l的比例与破碎后的菌液混合，萃取时间为40分钟：色素提取液经0．451am的微孔滤膜过滤纯化后采用高效液相色素分析的方法，经反复试验确定了两种HPLC分析流动相：流动相I为CH2Ch：CH30H：CH3CN：H20=32：38：29：1(v：v：v．v)，检测时长为10分钟；流动相II为CH30H：CH3CN=40：60(v：v)，捡测时长为6

4、0分钟。利用上述获得的光合细菌类胡萝h素提取方法和检测方法，对实验室保存的光合细菌菌株产生番茄红素能力进行了比较，得到了番茄红素产生量较高的菌株置azotoformansY6，其番茄红素产量为8．02xlo．3me,a-．。研究了培养基中加入不同浓度的小分子效应物吡啶、Triton．x100、Span-20、B．紫罗酮、异烟肼对番茄红素产量的提高作用，结果显示培养基中加入很低浓度的吡啶(O．1ml／L)就会对茵体产生很强的毒害作用：lriton-x100对类胡萝卜素的合成也有很强的抑制作用，试验的浓度为0．2mFL到5m班，，结果发现它对菌

5、体的生长和番茄红素的合成都有抑制作用；p．紫罗酮在浓度为O．05ml／L时有很小的促进作用，而浓度升高就有了比较强的抑制效果；span．20在液体培养基中的加量为2．0mFL对．对番茄红素的合成有很强的促进效果。产量达到了2．4xlo-2mg，L，比原始菌株产晕提高了2倍，而浓度进～步增大就产生了很强的抑制效果。对固氯红细菌俾．azotoformansv6)的五个色索突变株细胞的类胡萝卜素进行提取，．采用高效液相色谱一质谱连用的方法分析色素突变株的色素组成，总结得到了固氮红细菌完整的类胡萝卜素合成途径，由GGpp丌始首先经中fHj产物八氢番

6、茄红素山东大学硕士论文和‘．胡萝卜素合成了链孢红素，然后少量的链孢红素继续脱氢形成了番茄红素，而大量的链孢红素在羟基链孢红素合成酶的作用下合成了羟基链孢红素，羟基链孢红素接下来转变为甲氧基链孢红素，甲氧基链孢红素又转变为最终产物球形烯和球形烯酮。终产物球形烯和球形烯酮是野生固氮红细菌细胞合成的主要色素。本论文在国内外首次发现固氮红细菌能合成少量的番茄红素．R．azotoformansY6的一株绿色突变株yml色素分析结果表明，该菌株细胞中大量累积链孢红素(25．6mg，L)和番茄红素(1．29mg，L)，番茄红素的含量是突变前原始菌株的16

7、4倍。在It．azotoformansY6类胡萝h素合成途径中，催化链孢红素进一步羟基化转变成羟基链孢红素的酶是羟基链孢红素合成酶，其基因为crtC基因。本论文对可能发生突变的crtC基因进行了初步的研究。分析了固氮红细菌和类球红细菌(RhodobactersphaeroJdes)以及荚膜红细菌(Rhodo／口actercapsuJatus)的crtC基因核苷酸序列的同源性，利用高保守区核苷酸序列设计了一组简并引物，引物序列为PrimerF：5'-at(tc)甙ge)ctt(ct)atcgg(cta)tc(ga)gte一3’，PrimerR

8、1：5'-aagc(gt)cca(tg)ccgg(gc)gcggcg-3’，Primerl也：5'--=ac(tcXte)(tg)gcccg(tg)egcggcae-3’，PCR