抗登革病毒e蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文抗登革病毒E蛋白单克隆抗体的制备和鉴定摘要目的：登革病毒(Denguevirus，Dv)感染致死率高，登革热在世界范围内发病率不断升高，而目前尚无有效疫苗和特效药物，因此登革病毒感染的快速诊断有重要意义。登革病毒包膜蛋白E蛋白是重要的抗原蛋白，与免疫保护密切相关。本研究通过原核表达纯化E蛋白，利用杂交瘤技术制备DV—E特异性单克隆抗体，为进一步制备胶体金试纸奠定基础。方法：1．采用PCR法扩增E基因片段，原核表达载体pET32-a及PCR产物经双酶切后，用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM109构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入

2、表达宿主BL21感受态细胞，经IPGT诱导表达，对表达蛋白进行SDS．PAGE电泳分析和Western．blot检测。以Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白。2．用重组E蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，采用杂交瘤技术，制备抗DV-E的单克隆抗体，用ELISA方法筛选分泌抗DV-E单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用间接ELISA方法和Western．blot进行McAb特异性鉴定；同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类，检测McAb的效价。重庆医科大学硕士研究生学位论文结果：1．采用PCR方法扩增得到与预期大小一致的目的基因片段。重组质粒经PCR鉴定及测序分析证实

3、重组质粒克隆成功，命名为pET32．a．E。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为70kD的重组E蛋白，与预期分子量相符。Westem．blot检测表明诱导表达的融合蛋白能与抗DV的血清发生特异性结合。采用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化得到重组蛋白。2．成功筛选出一株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞7C7，其抗体亚类为IgGl：将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb／c小鼠腹腔中制备腹水型DV-E的单克隆抗体，酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水效价可达10一；Western．blot鉴定结果提示该单克隆抗体可以特异结合DV-E。结论：综上所述，我们运用重组DNA技术

4、与原核表达方法获得了重组E蛋白，利用该蛋白成功制备了抗DV-E单克隆抗体，所得抗体具有生物学活性，其抗体亚类为IgG。。为进一步制备快速检测登革病毒的胶体金试纸条奠定了坚实的基础。关键词：登革病毒；单克隆抗体；生物学特性；E蛋白4重庆医科大学硕士研究生学位论文PREPARATIoNANDCHARACTERIZATIoNoFMoNoCLoNALANTIBoDYAGAINSTDVENVELoPEPRETEINABSTRACTobjectives：Dengue(DV)diseaseisalife—threateningdisease．AndnowadaystheinciDVceo

5、fDenguefever(DF)isincreasingintheworld．Butwehavehadnoutilityvaccinumandspecificmedicineyet．SorapiddiagnosisoftheDengueviralinfectionisimportantandemergent．TheEprotein，envelopeprotein．ofDVisanimportantantigenproteinandintimatetoimmunoprotectionofDengueinfection．Inthisstudy,weconstructedapro

6、karyoticexpressionvectortoexpressDV-EinE．coliandobtainedpurifiedEfusionprotein．Then，thespecificmonoclonalantibodies(McAbs)againstDV-Ewerepreparedbyhybridomacelltechniques，whichservedasabasementofthegoldcolloidtestpaper．Methods：PCRwasdeployedtoamplifyEgenesegment．Afterdoubleenzymedigestion，

7、prokaryoticexpressionvectorpET32一aandPCRproductswereconjunctedbyT4DNAligaseandconvertedintoE．coliJMl09toconstructandbiopantherecombinantplasmidwhichwastransformatedintoE．coli-BL21later．AfterbeindutedbyIPGT,thefusionproteinwasmigrationin重庆医科大学硕士研究生学位论文SDS—PAGEg