腺病毒载体介导的rnai抑制肺间质纤维化大鼠tgfβ1基因表达的研究

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1、：．：?≮：o；i原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：泛。1审日期：跏，D年j月／日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本

2、学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：函章日期．厶7D年J月莎日摘要腺病毒载体介导的RNAi抑制肺间质纤维化大鼠TGF-B1基因表达的研究研究生刘霞。导师张国俊郑州大学第一附属医院呼吸内科中国郑州450052摘要背景纤维化可导致器官结构破坏和功能减退、乃至衰竭。肺间质纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是由多种因素引起的一组肺问质弥漫性疾病

3、，是异质性疾病，也是多种肺疾病的共同结局，其发病机制复杂，研究证实肺间质纤维化的发生、发展与转化生长因子．BI(TGF．131)的高表达密切相关。转化生长因子．13I(TGF一131)是公认的肺间质纤维化形成和发展中的“开关性"细胞因子，作为一种多功能及强效的致纤维化因子，参与调控细胞的分化、增殖及细胞外基质(extracellularmembrane)分泌，增加ECM的聚积并抑制其降解，在肺纤维化形成过程中主要作用于胶原的转录和翻译过程，诱导前胶原mRNA的产生，促进胶原蛋白的形成和沉积，是纤维化发生过程中最直接的一种细胞因子。抑制TGF．131基因表达显

4、然有助于延缓肺纤维化进程，而应用常规抗纤维化药物抑制其表达的效果并不理想。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是新近出现的一种分子生物学技术，它通过导入由对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)，诱导受体细胞中与其有同源序列的特异性靶mRNA降解，阻止蛋白质的翻译过程，其作用类似于基因敲除，但基因表达并未永远消除，因而又被称为“基因沉默”。摘要目的本研究针对大鼠TGF．13l的mRNA序列设计、合成并构建具有特异性阻断大鼠转化生长因子131(TGF一131)基因的TGF．131siRNASh

5、uttle载体，然后重组入腺病毒载体，包装成转化生长因子受体B1(TGF．131)siRNA的腺病毒，将腺病毒载体局部转染肺问质纤维化大鼠，观察并分析其对TGF．13lmRNA表达的抑制作用，为肺纤维化的防治提供实验依据。材料和方法‘60只SD雄性大鼠，生理盐水对照组、重组复制缺陷型TGF一131腺病毒治疗组、空载体对照组，第0d经气管滴入0．3ml的博来霉素(BLM3mg／kg)建立肺间质纤维化模型，空白对照组大鼠滴注等体积生理盐水，治疗组于滴入博来霉素24h后经鼻滴入重组复制缺陷型TGF．IBl腺病毒(AdCMVTGF．61)lox109空斑形成单位(p

6、fu)(1001-tl／鼠)，生理盐水组于造模后24h经鼻滴入同体积的生理盐水，同时设立无外源活性基因的复制缺陷型腺病毒(AdCMVNuII)空载体对照组，空白。对照组于24h给予气管内滴入同体积生理盐水。各组动物于7、14、28d随机处死5只，取肺组织肺行苏木精伊红(HE)染色；免疫组化法检测肺组织TGF一131的蛋白表达水平；荧光定量PCR检测肺组织中TGF．13mRNA的表达水平；ELISA法检测血清中TGF．B的蛋白的表达水平，评价其对全身的影响。结果HE染色示治疗组各时期肺泡炎和肺纤维化程度均较生理箍水对照组及空载体对照组轻；免疫组化结果显示治疗组

7、与生理盐水及空载体对照组相比肺组织TGF．t31蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0．05)；实时荧光定量PCR结果显示治疗组TGF．BlmRNA表达水平与生理盐水及空载体对照组比较降低，差异有统计学意义(P0．05)。结论腺病毒介导的RNAi可以抑制肺纤维化鼠肺组织TGF．131的表达，减轻肺纤维化大鼠肺泡炎和肺纤维化，对血清中酌TGF．131表达影响较小，有望成为防治肺问质纤维化的一种手段。IIIAbstractTheStudiesonInterferenceEffectof

8、RNAiMediatedbyAdenovirusVe