糖基化终产物促发巨噬细胞源性泡沫细胞形成机制的实验研究

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1、第三军医大学博士学位论文糖基化终产物促发巨噬细胞源性泡沫细胞形成机制的实验研究摘要糖尿病(DiabetesMellitus，DM)患者容易发生动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)，且时间早，进展快、范围广、预后差，即所谓加速性AS，是DM致死、致残的重要原因。研究表明，持久的高血糖状态可导致DM患者体内许多结构和功能蛋白质、脂质甚至核酸发生糖基化，经过一系列非酶促反应，即Maillard反应，形成Schiff碱，经Amadori反应重排后，最终形成具有高度活性、结构多样的糖基化终产物(advancedgly

2、cationendproducts，AGEs)，后者通过与细胞表面特异性AGEs受体(receptorforAGEs，RAGE)相互作用而发挥一系列的血管病理作用，加速糖尿病性AS的发生、发展。泡沫细胞形成是AS发生的早期事件和关键环节，胆固醇酯在巨噬细胞中大量沉积则是泡沫细胞形成的重要原因，这一过程受清道夫受体、酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶一1(acyl—coenzymeA：cholester01cyltransferase一1，ACAl乙1)和ATP结合盒转运子(ATP-bindingcassettetranspone

3、rAl，ABCAl)共同调节。ACALT-1是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸酯化形成胆固醇酯的酶，在单核／巨噬细胞中主要以ACAIT-1形式存在。病理条件下，巨噬细胞ACABl高表达，导致细胞内胆固醇酯大量堆积而形成泡沫细胞，这就是AS的早期病变，可见ACAIT_1是巨噬细胞源性泡沫细胞形成的主要介导者。然而，有关AGEs促发巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用是否与巨噬细胞ACALT-1的表达变化有关，目前尚不清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体1，(peroxisomeproliferatoractivatedrecept

4、o卜Y，PPARY)是一类由配体活化的核转录因子，属于核受体超家族成员，与脂肪细胞分化、炎症反应、胰岛素敏感性、细胞周期调节、As及肿瘤等关系密切。研究表明，PPARl，在单核细胞分化为巨噬细胞时表达，在维持巨噬细胞脂质代谢平衡过程中占有主导地位，但目前对于核受体PPARY在加速性AS发生、发展中的作用尚有争议。此外，核受体PPARl，是否调节着巨噬细胞ACAT一1的转录尚未见报道。目的本研究试图从AGEs影响巨噬细胞ACA．T-1和PPAR丫及其下游基因表达这一角度，第三军医大学博士学位论文阐明AGEs促发AS巨噬细胞源

5、性泡沫细胞形成的作用机制。为此，我们以体外培养的THP一1细胞为实验对象，进行以下研究：l、AGEs对巨噬细胞ACAT一1基因表达的影响；2、AGEs对巨噬细胞核受体PPARY及其下游SR—A基因表达的影响；3、研究比较巨噬细胞AcAPl与PPARY之间的相关性；4、通过观察PPARl，的合成型配体罗格列酮对AGEs诱导的巨噬细胞ACAT．1表达的作用，探讨PPAR丫活化在糖尿病性AS中发挥血管保护作用可能的机制。方法1．按标准的方法用D一葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA)共同孵育12周制备糖基化牛血清白蛋白(AGE—BSA)

6、，即AGEs。2．THP—l单核细胞培养于RPMll640完全培养液中，于37℃、5％C02培养箱中静置培养，每隔3～5天传代一次。用终浓度为O．1“M的PMA诱导THP一1单核细胞72h，使其分化成巨噬细胞。3．分别用浓度为50、100、200和400mg／L的AGE—BSA干预巨噬细胞24h，以100mg／LBSA作为对照组。同时用200mg／LAGE—BSA分别处理细胞O、12、24、36h和48h。4．运用免疫细胞化学方法检测巨噬细胞PPARY及其下游SR—A的表达，了解AGEs对巨噬细胞PPARY和SR．A蛋白表

7、达的影响。5．运用RT-PCR和Westemblot方法检测巨噬细胞ACA卫1和PPAR丫基因和蛋白的表达，同使用EMSA检测巨噬细胞PPARY的DNA结合活性，了解AGEs对巨噬细胞ACAnl和PPARl，表达的影响。6．分别以PPAR丫激动剂和PPAR^r抗体刺激巨噬细胞，运用RT_PCR和Westemblot方法检测巨噬细胞PPAR丫和ACA-T-1基因和蛋白的表达情况，明确巨噬细胞ACAlT-1和PPARY之间的相关性。7．以PPARY激动剂罗格列酮预处理巨噬细胞4h，再用AGE．BSA刺激巨噬细胞，运用ImPCR

8、和w色stemblot方法检测巨噬细胞ACABl基因和蛋白的表达，明确罗格列酮对AGEs诱导的巨噬细胞ACAT．1表达的影响。结果1．荧光分光光度计上分别测定AGE—BSA和BSA的荧光值，AGE—BSA为180．5荧光单位／mg蛋白，BSA为2．98荧光单位／mg蛋白。2．经0．1umol／LPMA诱