糖基化终产物对u937细胞巨噬细胞炎性蛋白1α mrna表达的影响

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1、糖基化终产物对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA表达的影响【摘要】目的探讨糖基化终产物(AGEs)对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA表达的影响，及AGEs在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法将U937细胞用不同浓度（100、200、400mg/L）AGEs孵育24h及同一浓度（400mg/L）AGEs孵育0、12、24及36h，采用原位杂交(PTPCR)方法检测巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA的表达水平。结果对照组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白1α呈弱表达；100、200及400mg/LAGEs孵育24h后

2、，各组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA表达的平均积分光密度值较对照组均显著升高（P＜0.05）；400mg/LAGEs孵育12、24及36h后，各组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA表达的平均积分光密度值均高于0h（P＜0.05）。结论AGEs以时间及剂量依赖的方式促进U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA的表达。【关键词】动脉粥样硬化;糖基化终产物;U937细胞;巨噬细胞炎性蛋白1α糖尿病患者由于动脉粥样硬化（AS）而发生的心脑血管病、肢端坏疽等并发症均明显高于非糖尿病人群〔1〕，且发生早、进展

3、快、预后差，是当今糖尿病患者致死致残的重要原因，确切机制尚不清楚。糖基化终产物(AGEs)是蛋白质非酶糖化的终末不可逆聚合物，以高水平聚集在糖尿病患者体内。近年大量研究证明，AGEs因介导多种病理过程在糖尿病血管并发症的发病中起重要作用。巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP1α）属于CC型趋化因子，对病灶中单核细胞及淋巴细胞的招募起着重要作用。本研究旨在探讨AGEs在糖尿病As中的作用。1材料与方法1.1材料人单核细胞株Ｕ937细胞购自中科院上海细胞所；RPMI1640培养基GIBCO公司；胰蛋白酶、D

4、葡萄糖、牛血清白蛋白购自华美公司；DEPC购自SIGMA公司；胎牛血清购自郑州佰安生物工程有限公司；佛波酯(PMA)购自Sigma公司；Trizol、逆转录试剂盒试剂购自美国GIBCO公司；MIP1α引物由上海生物工程有限公司合成；DNAmarker（фX174HincⅡdigest）购自大连宝生物工程有限公司。1.2AGEs的制备参照Horiuchi等〔2〕的方法将1.6g牛血清白蛋白（BSA）与3.0gD葡萄糖溶于10ml0.5mol/L（pH7.4）PBS中，0.22μm微孔膜滤过除菌，37℃孵育

5、90d，实验前用0.5mol/L（pH7.4）PBS透析去除未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，余条件一致。1.3U937细胞培养及分组Ｕ937细胞在10%FBSRPMI1640培养基中悬浮生长,每2～3d传代一次。加入0.1μmol/L佛波酯诱导分化48ｈ。实验组分为两组：不同浓度组分别于含100、200及400mg/LAGEs的无血清培养液培养24h；不同孵育时间组于含400mg/LAGEs的无血清培养液分别培养0、12、24及36h；对照组加含未修饰BSA的无血清培养液培养。所有实验均重复3次。1.4细胞总

6、RNA的提取及逆转录聚合酶链反应收集各组细胞，用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。取各组细胞的总RNA各1μg,按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，取2μlcDNA进行PCR循环(94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸2min,共35个循环,末次延伸72℃10min,4℃储存)。MIP1α引物序列〔4〕为:正链5′CTGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG3′,负链5′CTGCCGGCTTCGCTTGGTTA3′,PCR扩增产物

7、长度为197bp；βactin引物序列为:正链5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′,负链5′CATCTCTTGGTCGAAGTCCA3′,扩增产物长度为308bp。PCR体系总反应体积为50μl，包括1×PCRbuffer，1.5mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTP,引物各20pmol/L,Taq酶2U。反应后取终产物10μl在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离,应用凝胶成像系统（美国αinno

8、tach公司IS5500型）分析软件测定条带吸光度值,计算MIP1α/βactin积分吸光度比值。1.5统计学处理所有数据采用x±s表示。组间差异显著性比较采用单因素方差分析。2结果2.1分化细胞的形态Ｕ937单核细胞呈圆形、悬浮生长;经0.1μmol/L佛