野生型mxa蛋白及其突变体抑制hbv复制活性研究

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1、博士学位论文野生型MxA蛋白及其突变体抑锘IJHBV复制活性及意义博士研究生：余治健指导老师：骆抗先(教授)侯金林(教授)摘要研究背景MxA蛋白由662个氨基酸残基组成，是大GTP酶蛋白超家族成员和动力素超家族成员，分子量为76KD。MxA蛋白有GTP酶活性，即该蛋白有结合GTP的活性和水解GTP能力。MxA蛋白通过N端氨基酸GTP结合元件结合外源性GTP；C端氨基酸含有GTP酶水解效应区，能够将内源或外源GTP降解为GDP。MxA第83位氨基酸位于N端GTP结合元件的关键位点，K83A变异MxA

2、蛋白失去结合GTP的能力，但C端GTP酶水解效应区仍能降解外源性GTP；第612位氨基酸位于MxA蛋白C端GTP酶水解活性区域，L612K变异MxA蛋白失去酶解内源或外源GTP活性，但仍能通过N端GTP结合元件结合GTP。第103位氨基酸是位于MxA蛋白N端GTP结合元件的另一关键位点，T103A变异MxA同时失去结合GTP能力和水解GTP的活性。由于K83A、T103A和L612K位点变异MxA蛋白与GTP酶功能密切相关，因此，它们较多用于MxA蛋白GTP酶活性相关功能的研究。MxA蛋白抗RNA

3、病毒活性与其自身的GTP酶活性密切相关，即MxA蛋白可能在结合和分解GTP的同时发挥抗病毒作用。K83A位点变异不能抑制InfluenzaAvirus，Vesieularstomatitisvirus复制：T103A变异MxA蛋白失去对InfluenzaAvirus，Vesicularstomatitisvirus，Togotovirus的抑制作用；L612K变异MxA蛋白虽然失去了降解GTP的能力，能够抑制Thogovirus和Vesicularstomatitisvirus的复制，但较野生型蛋

4、白抑制能力下降10倍。E645R变异发生在MxA蛋白C段GTP酶功能区域第二个亮氨酸拉链结构，该位点变异不影响GTPase活性(结合GTP和水解GTP的能力均不受影响)，但特中文摘要异性的失去抗LACV(Iacrossvirus)、CCHFV(crimean—congohemorrhagicfevervirus)活性和VSV活性而保留对InfluenzaAvirus和THOV(Thogotovirus)的抑制活性。近年有报道MxA蛋白对DNA病毒乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV

5、)也有明显的抑制作用，但GTP酶活性是否对MxA蛋白抑制HBV复制活性有着关键性的影响尚不清楚。体外研究表明MxA蛋白特异性的干扰RNA病毒核壳组装和形成可能是其发挥抗病毒作用的主要机理，但MxA并不能直接与HBV核壳蛋白相互作用；MxA抑制HBV复制的过程中对病毒总RNA水平没有影响，但导致核内前基因组RNA(pregenomie3．5kbmRNA，pgRNA)增多而胞浆分布明显减少，推测MxA蛋白可能通过抑制pgRNA从核内向胞浆转运从而抑制HBV复制；乙型肝炎病毒转录后调节元件(Hepati

6、tisBvirusposttranscriptionalregulatoryelement，HPRE)是介导pregenomic3．5kbmRNA核外移的关键元件之一，体外实验表明MxA可作用于HPRE序列介导的mRNA核外移；推测MxA蛋白可能通过影响HPRE介导的pgRNA核外移从而影响HBV蛋白合成、包装和抗原的分泌。但MxA蛋白是否在核内或核周发挥这一作用?通过提高核内核周MxA蛋白浓度是否能提高其抑制HBV复制能力?这些问题尚未见报道。研究目的l、研究MxA蛋白在Hep02细胞中抑制HB

7、V复制活性。2、E645R变异是否影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。3、GTP酶活性是否是影响MxA蛋白抑制HBV复制的关键因素。4、MxA蛋白是否主要抑制HBV的核内复制阶段。研究方法l、野生型和GTPase缺陷型MxA蛋白表达载体的鉴定：peDNA3．1．Flag-MxA(wild—type)，peDNA3．1-Flag-MxA-K83A，peDNA3．1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3．1．Flag．MxA-L612K重组载体转化DH5a，挑选阳性克隆，经过PCR鉴定和双酶切鉴定

8、后进一步测序鉴定；测序结果与pubmed公布序列通过DNAsis软件比II博士学位论文对。用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)中量抽提以上各质粒和空质粒pcDNA3．1(+)。2、野生型MxA蛋白抑制HBV复制活性研究：用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)大量抽提重组质粒pUl9-1．24HBV。常规方法培养HepG2细胞。按5×106细rft／ml将细胞接种到直径10cm细胞培养皿中培养24小时细胞贴壁后待转染。转染方案采用pcDN