ub-hbcag-ctp融合蛋白诱导特异性ctl抑制转基因小鼠hbv复制的实验研究

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1、上海交通大学硕士学位论文Ub-HBcAg-CTP融合蛋白诱导特异性CTL抑制转基因小鼠HBV复制的实验研究硕士研究生：卓萌学号：1127259584导师：汤正好专业：内科学（感染病学）研究方向：慢性乙型肝炎的临床与基础治疗申请级别：硕士（专业学位）培养单位：上海交通大学附属第六人民医院基金项目：国家自然科学基金面上项目（81270502）上海市自然科学基金（11ZR1427100）答辩日期：2015年4月30日DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityforthedegreeofMasterT

2、HEEXPERIMENTALSTUDYOFSPECIFICCTLSINDUCEDBYUB-HBCAG-CTPTOINHIBITHBVREPLICATIONPh.Dcandidate:MengZhuoStudentID:1127259584Supervisor:Prof.ZhenghoTangMajor:InternationalMedicine(InfectiousDiseases)ResearchField:ClinicalandbasicresearchofchronichepatitisBAffiliated:ShanghaiJiaoTong

3、UniversityaffiliatedtoSixthPeople’sHospitalFundProject:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81270502)NaturalScienceFoundationofShanghai(11ZR1427100)DateofDefence:April30,2015上海交通大学硕士学位论文Ub-HBcAg-CTP融合蛋白诱导特异性CTL抑制转基因小鼠HBV复制的实验研究摘要目的：探讨泛素（Ubiquitin）修饰乙肝病毒核心抗原肽（HBcAg）经胞质转导肽（CT

4、P）转导在HBV转基因小鼠体内诱导分泌Th1型细胞因子及HBV特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应，并进一步验证融合蛋白Ub-HBcAg-CTP在转基因小鼠体内的抑制HBV病毒复制功能。方法：1.BALB/c-HBV转基因小鼠随机分为实验组Ub-HBcAg-CTP（50μg），对照组HBcAg-CTP（50μg）、Ub-HBcAg（50μg）、IFN-a（20000IU）、HBcAg（50μg）及空白组（PBS）分别肌肉注射免疫转基因小鼠，每周1次，共免疫3次。通过酶联免疫吸附法（ELISA）、固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测T淋巴细胞分

5、泌Th1细胞因子；流式细胞术（FCM）检测T淋巴细胞内的细胞因子；乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测T淋巴细胞的杀伤活性。2.HBV转基因小鼠随机分为实验组Ub-HBcAg-CTP（50μg），对照组HBcAg-CTP（50μg）、Ub-HBcAg（50μg）、IFN-a（20000IU）、HBcAg（50μg）及空白组（PBS）经肌肉免疫小鼠，每周1次，共3次。分别于免疫过程中第2周及第4周对免疫小鼠行内眦取血，获取各组血清共2次，分别通过微粒子酶免疫分析法（MEIA）对2次小鼠血清行乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平检测，荧光定量聚合酶链反应（PC

6、R）分别测定2次血清中HBVDNA水平，并用免疫生化检测末次血清的AST、ALT水平，同时对免疫后小鼠肝脏组织行HE染色及免疫组织化学检测肝组织中HBsAg、HBcAg蛋白表达水平。结果：1.实验组融合蛋白Ub-HBcAg-CTP能有效诱导HBV转基因小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子；FCM检测实验组融合蛋白能有效增加特异性CTL数量，所诱导的CTL水平明显高于其他组；且Ub-HBcAg-CTP融合蛋白诱导的T淋巴细胞CTL活性明显高于对照组及空白组（p值均<0.05）。2.Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫转基因小鼠后，实验组小鼠血清中HBs

7、Ag及HBVDNA水平较其他对照组均明显降低，表示Ub-HBcAg-CTP对转基因小鼠体内HBV水平有一定抑制作V上海交通大学硕士学位论文用，且Ub-HBcAg-CTP组小鼠血清中AST、ALT水平高于其他对照组（p值均<0.05）。同时实验组小鼠肝脏组织HE染色显示炎性细胞的数量明显增多，而免疫组化分析显示其肝组织中HBsAg、HBcAg蛋白表达量明显减少。结论：强制泛素修饰抗原肽HBcAg经CTP转导免疫HBV转基因小鼠，能够刺激小鼠体内T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子（IL-2和IFN-γ）及有效提高体内特异性CTL的表达水平，同时能增强T淋巴

8、细胞CTL活性。Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫HBV转基因小鼠后能增加小鼠体内HBV特异性CTL数量，从而有效降低血