小鼠胚胎干细胞直接诱导分化为功能性肝脏细胞的研究

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1、中IIl大学硕士学位论文小鼠胚胎干细胞直接诱导分化为功能性肝脏细胞的研究小鼠胚胎干细胞直接诱导分化为功能性肝脏细胞的研究专业：干细胞与组织工程硕士研究生：陈银银导师：闵军教授摘要目前，对于肝功能衰竭(如肝坏死、肝硬化等)和肝脏相关的遗传性疾病的治疗主要依赖于原位肝移植，但供体肝来源严重不足和移植排斥等问题限制了这一治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和牛物人工肝作为肝移植的辅助方式，可以部分缓解上述问题，但其来源细胞同样也面l临着存活期短，特别是随着培养时间的延长，肝功能逐渐降低等问题，因此，寻找合适的肝细胞来源己成为一个十分紧迫的课题。胚胎干细胞(emb叫onicStemcelI，ESCs)是来源

2、于囊胚内细胞团的一种高度未分化细胞，具有无限增殖和发育全能性等特点，可白发分化为多种细胞类型，在特定的诱导条件下，也可以向某种组织细胞类型分化。目前，已知ESCs可定向分化为神经细胞、心肌细胞、造血细胞、平滑肌细胞、软骨细胞等多种细胞类型。在非肝源性肝干细胞研究领域，自从2001年Hamazaki等【1】首次报道诱导ESCs分化为肝脏细胞以来，ESCs源性肝脏细胞的体外研究在多个研究中心迅速开胰起来，目前已明确可以由ESCs获得表达肝脏特异性标志物的肝细胞样细胞。但至今仍没有建立一个统一高效的诱导胚胎干细胞向肝细胞分化的培养体系。本课题拟运用不经过拟胚体(Embqoidbody，EBs)途径的

3、直接诱导方法，探讨表观遗传修饰物质J‘酸钠(sodiumbu坶ra钯，SB)联合多种细胞因子体外诱导小鼠中山大学硕士学位论文小鼠胚胎于细胞直接诱导分化为功能性肝脏细胞的研究胚胎干细胞分化为功能性肝脏细胞可行性，建立有效的诱导胚胎干细胞向肝细胞分化的培养体系。并在此研究基础上，利用在诱导过程中消化传代的方法，提高ESCs源性肝脏细胞的获得效率，解决由于长时问诱导带来的如细胞老化、功能下降等一系列问题，从而为将来ESCs源性肝脏细胞移植治疗各种难治性肝病提供理论和实验依据。小鼠胚胎干细胞直接诱导分化为功能性肝脏细胞目的运用直接诱导的方法，探讨表观遗传修饰联合多种细胞因子体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为

4、功能性肝脏细胞可行性，建立有效诱导胚胎干细胞向肝细胞分化的培养体系。方法用RT-PcR检测pou5f1基因的表达鉴定E14小鼠胚胎干细胞(embryonicstemceIl，ESCs)的未分化特性，然后常规培养增殖ESCs。诱导开始：传代ESCs，消化成单细胞悬液后以l×104的密度种入6孔板，按诱导进程依次添加：碱性成纤维细胞牛K因子(baSic肋robl2Lstgr0州hf．actor，bFGF)、丁酸钠(sodiumbutyrate，SB)、骨形态形成蛋白一4(bonemorphogenicprotein．4，BMP一4)、肝细胞生长因子(hepatocytegro叭hfactor，HG

5、F)、制瘤素(oncostatinM，OSM)地塞米松(DexamethaSone，Dex)进行分组诱导(见表1)，整个诱导过程持续十六天。分化过程中用光学显微镜观察各组细胞密度及形态学改变；RT．PCR检测各组肝细胞特异性标志基因白蛋白(aIbumin，ALB)、甲胎蛋白@一fetoprotein，AFP)、甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)、nl抗胰蛋白酶@l—antit拶psin，AAT)、酪氨酸转氨酶(tyrosineaminotransferaSe，W汀)、肝细胞核因3D(hepatocytenuclear最lctor3p，HNF3p)、肝细胞核因子4a(hepa

6、toc”enuclearfactor4Q，HNF4Q)、细胞角蛋白18(cytoker砒inl8，CKl8)、细胞角蛋白19(c)，tokeratinl9，CKl9)、胆固醇70E一羟化酶Al(Cholesterol7Q-hydroxyIaseAl，CYP7A1)的mRNA表达；免疫荧光化学分析检测肝细胞特异性标志蛋白ALB、AFP、CYP7AI、FVIII、FIX的中山大学硕士学位论文小鼠胚胎干细胞直接诱导分化为功能性肝脏细胞的研究表达；通过糖原PAS染色试验和吲哚氰绿摄取试验检测诱导分化的细胞是否具有肝脏细胞功能；透射电镜观察是否出现肝脏细胞样的超微结构。将诱导7．8天的细胞按l：3比例消

7、化传代，传代后继续按原方案诱导，诱导过程结束后用血细胞计数器计算未经消化传代处理和经消化传代后细胞总数，RT．PCR检测消化传代处理对于肝脏特定基因表达的影响。表1分组诱导的不同时问段培养基组分注所用的试剂浓度分别为：丁酸钠2．5m啪I／L、bFGF10ng／mI、BMP-4lOng／mI、oSMlOng，ml、DexlO。7M结果1．分组诱导结果1．1光镜结果1．1．1细胞密度以I×104的密度