诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞的研究

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1、中国医科大学硕士学位论文诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞的研究姓名：李晓丰申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：庞希宁20080301·英文缩略语·7中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：乏查篮日期：趁呈：五：兰

2、中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书论文作者鲐盔墅∥指导教师签名：刨：兰醐·中文论著摘要·诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞的研究刖吾胚胎干细胞(Embryonicstemcells，ESCs)来自囊胚内细胞N(Irmercellmass，ICM)，在体外可长期自我复制，并且具有分化成内、中、外三个胚层细胞的多潜能性，研究表明其可在体外分化为神经细胞。而神经细胞被认为是终末分化细胞，其损伤后很难再由自体的神经干细胞补充，研究ESCs向神经细胞的分化不仅可以作为研究哺乳动物神经系统发育的体外模型，了解神经分化过程中基因表达调控的变化机制；还可以应用于临床，为神经系统疾病，如帕金森症、

3、脑卒中、癫痫，及脊髓损伤等患者进行细胞移植，使其尽快康复。但是，目前人们对胚胎干细胞向神经细胞分化的确切机制仍不够了解。本课题组前期已建立了将小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的“序贯诱导法”，本研究在优化“序贯诱导法”诱导条件的基础上，通过应用免疫荧光法和蛋白质免疫印记法对分化后细胞进行神经细胞标志物鉴定，并用流式细胞仪测定分化比率，为进一步研究胚胎干细胞向神经细胞分化的作用机理打下基础，以期揭示出胚胎干细胞分化的确切机制。方法1、饲养层细胞制备、ESCs培养及诱导分化使用原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)第24代状态好的作为饲养层细胞，mESCs(小鼠ES细胞系AB2．1，由美

4、国南加州大学医学院惠赠)接种培养于其上。诱导分化时去饲养层，重新接种于无包被的培养皿中，使用NSC培养液，逐渐更换为无血清NC培养液。2、“序贯诱导法”分化条件的优化(1)诱导分化时ESCs接种的密度梯度1(2)首次换用NSC培养液时培养液的浓度梯度(3)逐渐更换为无血清NC培养液的时间梯度3、鉴定诱导分化后细胞的特异性标志物(1)免疫荧光法检测神经干细胞及成熟神经细胞特异性抗原Nestin、NeuN、TU儿、NCAMl和GFAP(2)蛋白质免疫印记法(WesternBlotting)检测成熟神经元特异性标志物TU儿4、流式细胞仪测定NeuN阳性细胞百分比，计算诱导分化比率。实验结果l、

5、优化了“序贯诱导法”的诱导条件优化后“序贯诱导法”在分化时首次接种所用培养液的血清浓度为12．5％，mESCs最佳接种密度为1．0x105／ML，完全使用无血清NC培养液的时间应为诱导第5天。2、使用优化的“序贯诱导法"，可简便、高效、稳定的将ESCs诱导为神经元样细胞未分化的ESCs聚集成团状生长，细胞排列紧密，集落边界清楚。使用优化的“序贯诱导法”可将ESCs大比例诱导分化为神经元样细胞，光镜下观察细胞形态均一，胞体圆亮，突起细长。3、鉴定分化后细胞的神经细胞特异性抗原免疫荧光法检测神经干细胞及成熟神经元特异性抗原Nestin、NSE、NouN、TUJl和NCAMl表达阳性，神经胶质

6、细胞标志物GFAP表达阴性；蛋白质免疫印记法检测到成熟神经细胞特异性标志物TUJl表达阳性。4、流式细胞仪检测NeuN阳性细胞百分比，计算出诱导分化比率为89．91％士2．03％。2结论根据本研究所得的实验结果，可得出以下结论：l、优化的“序贯诱导法”可稳定诱导ESCs高比率分化神经元样细胞，并经过鉴定具有了成熟神经元特异性标志物，而可能正是这些标志物基因的程序性表达，与定向分化的机制相关。2、应用流式细胞仪将分化结果作了定量分析，明确得出诱导分化比率可达89．91％士2．03％。关键词胚胎干细胞；神经细胞；诱导分化3·英文论著摘要·Theinvestigationofneuraldif

7、ferentiationofmouseembryonicstemcellsIntroductionEmbryonicstemcells(ESCs)which孤．efromtheinnercellmass(ICM)ofpreimplantationblastulaarepluripotent．NeuronsareconsideredasterminallydifferentiatedcellsthatCallnotdividenorp