曲古抑菌素a对t细胞的影响与在大鼠肾脏移植中的应用

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1、博士学位论文曲古抑菌素A对T细胞的影响及在大鼠肾脏移植中的应用博士研究生：魏强指导教师：于立新教授摘要一研究目的：随着器官移植技术的发展，我国接受器官移植的患者逐年增多，这些患者术后需长期服用各类免疫抑制剂进行抗排斥治疗，尽管这些药物的作用机理和作用环节不尽相同，但都不可避免的具有毒副作用，而且某些免疫抑制剂的治疗窗较窄，药代动力学方面也存在明显的个体差异，需要密切监测药物浓度，给术后长期治疗增加负担。因此开发新型的针对性强、副作用小的免疫抑制剂就显得尤为必要。组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够调控组蛋白乙酰化／去乙酰化平衡从而在基因表

2、达调控、DNA复制及修复等过程中起着重要的作用，它参与多种基因的转录调控。我们研究的目的在于探讨曲古抑菌素A这种组蛋白去乙酰化酶抑制剂影响T细胞免疫功能的作用机制，包括对T细胞的活化和增殖这个器官移植的免疫过程的中心环节的影响、对免疫应答过程中具有重要意义的IL-2表达的影响，以及对异体大鼠肾脏移植模型中移植肾的影响，为其应用于器官移植领域的免疫治疗及诱导免疫耐受提供理论及实验依据。二实验方法：1．不同浓度TSA对小鼠外周血、脾脏T细胞数量检测：将40只昆明种小鼠随机分为5组，各8只。A组(空白对照组)：生理盐水0．5ml／kg

3、／d皮下注射；B组(CTX簦I)：CTX20mg／kg／d皮下注射；C组(TSA1组)：中文摘要TSA0．4mg／kg／d皮下注射：D组(TSA2组)：TSA0．8mg／kg／d皮下注射；E组(TSA3组)：TSA1．6mg／kg／d皮下注射；处理一周后分别取小鼠外周血及脾脏，其中脾脏制成脾细胞悬液。分离外周血及脾脏淋巴细胞，用a．醋酸萘酯酶染色法观察实验小鼠T细胞的数量变化情况。2．TSA对小鼠外周血、脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量及比值检测：同样取上述方法处理过的外周血和脾脏，分离外周血及脾细胞悬液中淋巴细胞，加入

4、Ratanti-mouseLyt2+及．Ratanti．mouseL3T4+荧光标记小鼠单克隆抗体，流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量并计算其比值。3．观察TSA对MLC中淋巴细胞增殖作用的影响分别取BALB／c及C57BLd,鼠脾脏制成单细胞悬液，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调细胞数为lxl06个／ml。两种淋巴细胞1：1混合后加入96孔板，每孔加入上述细胞悬液10011L及0．16、0．8、4、20、100、500nmo儿不同稀释度的TSA100I．tL，对照组用等体积RPMI．1640培养液代替，分别在作

5、用12h、24h及48h后每孔加入0．5％MTT209L作用4小时，经1500rpm离。C,,lOmin，弃上清液，再加入10011LDMSO溶液，用酶标仪于570nm波长下测oD值。每浓度设5个复孔，以未加TSA组细胞作为对照。根据OD值算出各组细胞抑制率的大小。4．TSA对激活淋巴细胞IL-2表达的影响制备C57BLdx鼠脾脏淋巴细胞悬液，并调整细胞数为1×106个／ml作为反应细胞；分离BALB／cdx鼠淋巴细胞，加入丝裂霉素75nmol／L，孵育30min后去除残余丝裂霉素，调整细胞数为1x106个／ml作为刺激细胞。实

6、验组取反应细胞及刺激细胞各lml，置于细胞培养板内，每组设6个复孔，分别加A．1pmol莫能霉素，放入37‘C，5％的C02孵箱培养，48h后按50l-tL／孔分别加入0。16、0．8、4、20、100、500nmol／L浓度TSA；阳性对照组用CTx代替TSA：阴性对照组使用I冲MI一1640培养液代替TSA。第4天取细胞，用IL-2荧光标记单抗染色后流式细胞仪分别检测各组荧光值。5．大鼠原位肾脏移植模型的建立H博士学位论文供体手术：取成年雄性Wistar大鼠，戊巴比妥腹腔麻醉后，取腹部正中T型切口，充分暴露左肾、腹主动脉和下

7、腔静脉。游离左肾并完全游离左肾动静脉，分别结扎、切断左肾动静脉主干各分支，在左肾动静脉上方阻断腹主动脉和下腔静脉，于左肾动脉下方穿刺腹主动脉并固定穿刺导管，剪开肾静脉下段下腔静脉，用4。C的HCA液经穿刺导管灌注，至肾脏变灰白，下腔静脉流出的灌注液清亮为止。游离输尿管至膀胱，带腹主动脉及下腔静脉瓣剪断肾动静脉，带膀胱瓣取下肾脏。置于冰水中迸一步去除肾动、静脉断端残余的脂肪及多余的外膜，从根部切断肾动静脉，修剪膀胱，保留输尿管开口周围膀胱瓣，供肾置于冰袋中保存备用。受体肾移植手术：SD大鼠同样取上述切口，充分游离左肾动、静脉，在靠

8、近腹主动脉及下腔静脉根部夹闭左肾动、静脉，在靠近根部约l／3处切断左肾动静脉，沿左肾下极切断并结扎左侧输尿管，摘除左肾。以11．0和9．0无创缝合线间断端端吻合供受者肾动静脉，开放血流后将膀胱瓣与受者膀胱做间断缝合。。6．观察移植肾的组织病理形态变化：成功构建9