猪pspⅱ蛋白基因调控序列的克隆及副性腺特异表达载体的建立

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1、滕尚辉猪PSP-II基因调控序列的克隆及副性腺特异表达载体的建立猪PSP-II蛋白基因调控序列的克隆及副性腺特异表达载体的建立摘要：PSP．II是公猪精浆中含量较高的蛋白，且在猪副性腺特异表达并分泌到精液中，为了建立猪副性腺特异表达载体，根据已发表的PSP．II5’和3’．调控区序列设计两对引物并引入酶切位点，用高保真PCR扩增了猪PSP．II蛋白基因的5’端和3’端的调控元件及启动子，长度分别约为4．1kb和3．1kb，并将PSP．II5’和3’．调控区序列分别克隆到pMDl8．TVector上，将

2、插入目的片段重组质粒送上海基康生物技术有限公司进行测序，测序结果Blast程序与已发表的序列的相应区域进行比对，结果表明PCR扩增的PSP．II5’端和3’端调控区前500bp与已发表的序列的同源性为99．8％、100％。为了建立猪附性腺暂态生物反应器，我们将已经克隆的PSP．II基因5’端和3’端调控序列，应用体外DNA重组技术连接到改造过的pcDNA3．0上，经鉴定将正确的目的克隆命名为pC，然后将报告基因EGFP插入pC载体的PSP．II5’侧翼区下游和3’侧翼区上游。为确定建立的载体是否表达及

3、表达的特异性，将pC-EGFP质粒及阳性对照pEGFP-N1质粒分别经PEI包裹手术转染ICR小鼠精囊腺，转染48h后，取小鼠精囊腺并提取mRNA用RT-PCR方法和做冰冻切片用荧光显微镜检测荧光蛋白基因的表达情况，结果表明pC-EGFP质粒可以驱动EGFP基因的表达。为确定表达的特异性，将pC-EGFP质粒经PEI包裹尾静脉全身转染ICR小鼠，转染48h后，取精囊腺、肝脏、心脏、肺和肌肉提mRNA和做冰冻切片，用RT．PCR方法和荧光显微镜检测各组织荧光蛋白的表达情况，结果表明pC．EGFP真核表达

4、载体具有很好的组织特异性。从而确定首次成功建立了猪附性腺特异表达荧光蛋白的载体。该载体的建立为猪附性腺高效表达技术体系深入研究奠定了基础。关键词：猪副性腺特异表达载体；PSP．II；基因克隆；基因表达8贵州大学硕士论文CloningofflankingregionofpigPSP一1IgeneandconstructionofAccessorySexGlandspecificexpressionvectorTeng—-shanghuiAbstract：Amongalloftheboarspermadh

5、esinproteins，PSP．Ⅱisamajorcomponentofboarseminalplasma,whichisaspecmcsecretaryproductofaccessorysexgland．InordertoconstructaccessorySeXglandspecificexpressionvectors，weclonedthesequencesof5’·and3'-flankingregionofPSP-IIbyPCRtechnology,accordingtothepubl

6、ishedsequenceofPSP—II，andthelengthofclonedsequencesisabout4．1kband3．1kb．ThetwoclonedfragmentswereinsertedintoPmdl8．TvectorandsequencedbyShallghaiGeneCoreBioTechnologiesCo．，Ltd．subsequently．ThesequencesweTeanalysisbyBlastprocess，theresultisthatthehomolog

7、ywas99．8％，100％offrist500bpofthe5’-and3'-flankingregionofPSP．II，indicatedthatthesequenceweclonedwascorrectly．Inordertoconstructaccessorysexglandbioreactor,the5'-and3'-flankingregionofPSP-11wereclonedandinsertedintomodifiedpcDNA3．0andformedtheaccessorysex

8、glandspecificexpressionvectorofEGFPgene．Totesttheexpressioncharacteroftheaccessorysexglandspecificexpressionvector,therecombinatvectorofPC-EGFPandthecontrolpEGFP-N1vectorweretransfectedwiththe10Reseminalvesicledirectlybyinjection