乌鳢胰蛋白酶分离纯化、性质的分析与分子克隆

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1、乌鳢胰脏中胰蛋白酶的分离纯化、性质分析及分子克隆摘要胰蛋白酶(Trypsin，EC3．4．21．4)是丝氨酸蛋白酶家族中的一种重要的肽链内切酶，能专一水解由赖氨酸(Lvs)和精氨酸(Arg)的羧基与其他氨基酸的氨基形成的肽键，在鱼体的生命代谢中具有重要的生理生化功能。目前，国内外已经报道了很多海水鱼类胰蛋白酶的研究，但是对于淡水鱼的报道却相对较少，而乌鳢是我国一种非常重要的经济鱼种，胰蛋白酶的生理功能对于该鱼的养殖和利用有着重要的意义。但是，迄今为止，该鱼中的胰蛋白酶的研究还未见报道。本课题以乌鳢为研究对象，对其胰脏中的胰蛋白酶进行分

2、离纯化、性质分析，并克隆得到胰蛋白酶原基因的全长序列，为今后研究鱼类胰蛋白酶的生理生化功能、饲料加工以及胰蛋白酶在工业中的应用提供理论依据。本课题通过硫酸铵盐析、柱层析(DEAE．Sepharose阴离子交换层析、SephacrylS．200凝胶过滤层析和Hi．TrapCapto—Q强阴离子交换层析)等方法纯化得到两种胰蛋白酶(胰蛋白酶A，TrypsinA及胰蛋白酶B，TrypsinB)。SDS．PAGE表明两种胰蛋白酶都得到高度纯化。胰蛋白酶A、B的分子量均为22kDa。肽指纹图谱结果显示，纯化的两种酶均为胰蛋白酶，胰蛋白酶A得到含

3、有25个氨基酸残基的2条肽段，胰蛋白酶B得到含有38个氨基酸残基的3条肽段，它们与红鳍东方纯胰蛋白酶原氨基酸序列完全比对。以荧光底物Boc．Phe．Ser．Arg．MCA为底物测得胰蛋白酶A和胰蛋白酶B的最适温度均为40oC，最适pH值均为9．0。两种胰蛋白酶的活化能分别为24．65l【J·M。1和22．271(J·M一。热稳定性实验表明纯化的胰蛋白酶在45oC以下孵育20分钟后酶的活性仍比较稳定，在50。C以上酶的活性急剧降低，酶表现不稳定。两种胰蛋白酶在40。C时的半衰期大约为60分钟，说明胰蛋白酶在最适温度下较容易发生自身降解导

4、致酶失活。pH稳定性实验表明两种胰蛋白酶在pH值为7．0．10．0时能较好地保持其活性，在酸性环境中胰蛋白酶活性不稳定，酶较容易失活。抑制剂实验表明丝氨酸蛋白酶类抑制剂，如MBTI、PefablocSC、PMSF、LBTI和Benzamidine等，能强烈抑制所纯化的胰蛋白酶A和胰蛋白酶B。金属蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂也能部分抑制胰蛋白酶的活性，说明在胰蛋白酶活性中心附近有金属离子或者半胱氨酸残基存在。这些结果表明纯化的两种蛋白酶均为胰蛋白酶。低浓度的Ca’+能增强酶的活性，而高浓度的Ca2+和其他金属离子都会不同程度地抑制

5、胰蛋白酶的活性。底物特异性实验表明所纯化的两种胰蛋白酶均对胰蛋白酶类特异性底物有较强的分解能力，且对底物Boc—Phe—Ser．Arg．MCA的分解能力最强，对其他蛋白酶类底物都不分解。胰蛋白酶A对底物P1位为Arg的底物分解较强，而胰蛋白酶B对底物P，位为Arg和Lvs的底物分解作用均较强，当底物P。位均为Arg而P2位或P3位氨基酸残基不同时，胰蛋白酶对底物的分解作用也是不同的，可见，P2位和P3位的氨基酸也能影响酶对底物的分解。底物特异性实验说明两种胰蛋白T酶在食物消化过程中发挥不同的作用。通过对特异性的底物进行动力学参数研究，

6、以Boc．Phe．Ser-Arg．MCA为底物，两种胰蛋白酶的‰分别为1．020和0．663／,M，‰at分别为148和116S～，催化效率‰。必，m分别为144．7和174．9SI／／％M，由此得出胰蛋白酶B对底物的催化效率高于胰蛋白酶A。结合肽指纹图谱结果并以胰蛋白酶保守位点为依据设计引物，采用5'-RACE、3'-RACE和RT-PCR方法，克隆得到一条916bp的cDNA，编码247个氨基酸，该基因序列的GenBank登录号为JN558641，相应的氨基酸序列GenBank登录号为AEM91638。该cDNA序列包括一个9bp

7、的5’一非编码区，744bp的开放阅读框和163bp的3’．非编码区。氨基酸序列中包含一段15个氨基酸残基的信号肽和9个氨基酸残基的酶原激活肽(TAP)，成熟的胰蛋白酶氨基酸序列包含223个氨基酸残基，成熟胰蛋白酶的理论分子量约为24．45kDa，其中His．64、Asp．107和Ser．201构成胰蛋白酶的催化三联体，该胰蛋白酶含有在脊椎动物胰蛋白酶氨基酸序列中保守的12个Cys残基，可以形成六个二硫键。通过分析胰蛋白酶原的氨基酸组成发现，含量最高的为丝氨酸(35个)，占氨基酸总量的14．2％，其次为甘氨酸(23个)，占氨基酸总量的

8、9．3％。通过对胰蛋白酶原的酶切位点进行分析可知，乌鳢胰蛋白酶原含有16个胰蛋白酶的酶切位点和22个胰凝乳蛋白酶的酶切位点，且酶切几率大于80％的分别有14个和17个，这说明胰蛋白酶在纯化过程中容易发生自身降解或被其他酶