抗cd20人鼠嵌合单克隆抗体在转基因小鼠乳腺中表达

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1、中园农业大学硕士学位论文摘要CD20是B淋巴细胞表面特异性抗原之一，在淋巴细胞分化甲期表达井H能激活淋巴细胞，导致淋巴细胞增殖分化。CD20抗原由丁其在淋巴细胞表面广泛存在和不会从淋巴细胞袭向游离进入血液循环的特性被选为治疗锌种淋巴癌症的靶蛋白。抗CD20的嵌台抗体由鼠抗人CD20可变区肽段和人抗体196恒定区肽段组成，临床实验证明嵌合抗体的治疗效果明显14副反席小，并且已经被美国FDA批准投入市场。目前嵌台抗体通过CHO癌细胞生产，但细胞的低表达昔自l细胞培养的高成本限制抗体的人龄生产。本研究的目标

2、就是制备高效表达CD20嵌台抗体的转基冈动物模刑。我们构建了乳腺特异性抗体轻链表选载体HuKlF-pBCl和重链表达载体HuGlF-pBCl，表达载体线性化后等比例混合，通过显微共注射受精卵雄原核的方法制蚤转基因小鼠。注射衍共出生52只小鼠，用PCR和Southern杂交的方法检测m5只(39，2d)烈链整合的转基因刖性小鼠，10只单链整合的转基因刚性小鼠。转基冈粘合率28．8％，双链整台率为9．6％。将双链整合的日l性小鼠和野牛型小鼠配种扩群，采集乳汁样^^。Western杂交检测转基因母鼠乳汁中抗

3、CD20战合抗体的表达。在F0代26，36号鼠．Fl代21，22，23号鼠中检测刮重组抗体的表达。E1．ISA进一步定母分析抗体在小鼠乳汁中的含鼙，其中F0—36，Fl一21号小鼠表达餐分别为O29m∥ml，0．31m∥mIF0．26表达量达7．6mg／ml，F1—22表达埔达143mg／ml，FI一23表达量高达17．7m∥ml。关键词：CD20，淋巴癌症，嵌合抗体，转基因小鼠AbstractCD20isaspecificBlymphocytesurfaceantigenItiswideexpres

4、sedattheearlystageofBlymphocytedevelopmentandplaysanimportantroleintheiractivationandproliferation．CD20hasbeenchosenasthetargetinthetherapyofallkindsoflymphomaforthecharacteristicofnotsheddingfromthesurfaceofCD20positivecellsandnotinterlizingintocellaft

5、erbindingtoantibody．ChimericCD20antibodyiscomposedofthemouseanti-humanCD20peptideinvariableregionandhumanIgGpeptideinconstantregion．Itrevealedseveraladvantagesandlessadveme—effectinclinictrialthanotherdrugsusedforBlymphomatreatment，andhasbeenapprovedbyF

6、DAillUS．Ain1997．Thechimericantibodyisproducedfromanti—CD20CHOcells，butthelowantibodyexpressionlevelof30ugprotein／10。cellsperdayandhighcostincellculturehavebeenastumblingblockinindustrialproduction．Theobjectofourresearchistomakethetransgenicanimalmodelto

7、expresstheantibodyathighlevels．Weconstructedaantibodylightchainexpressionvector(HuKlF—pBCllandaheavychainexpressionvector(ttuG1F-pBC1)，whicharebothspecificfortheproteinexpressioninmammaryglandThevectorsweremixedtogetherattheratioof1：1afterbeinglinearize

8、dbySalIandNotldigestion．Linearvectorsweredilutedto2．5rlg／ulandco-microinjectedintothepronucleioffertilizedeggs．Inthe52miceproducedbymicroinjection，5(3femaleand2male)founderlinemicewereidentifiedbyPCRandsouthernblottingcontainingb