海分枝杆菌感染斑马鱼模型在抗结核药物研发中的研究

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1、研究了海分枝杆菌BAA-535的致死剂量。同时，对临床抗结核药物异烟肼与利福平等在感染模型上进行了药效评价，结果表明经药物治疗后可明显降低感染的鱼卵的死亡率，呈现较好的量效关系，且与临床药效具有良好的相关性。1．材料与方法1．1材料1．1．1菌株Mycobacteriummarinum{strainATCCBAA-535／M)9,购自ATCC。1．1．2实验动物斑马鱼AB系，中国医学科学院医药生物技术研究所赠。1．1．3主要试剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)、利福平、异烟肼购自Sigma。1．2方法1．2．I注射位点采取卵黄囊射的方式，其具体注射位

2、点如图l所示。图l注射位点Fig1injectionsites1．2．2海分支杆菌注射液的制备细菌培养至OD600=l时收集茵液，离心后用无菌的含0．05％Tween80的PBS溶液清洗三次，将菌液悬浮于含2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)的PBS溶液中，并检测其OD600，最后稀释至溶液OD600=l时作为注射液。1．2．3海分枝杆菌对斑马鱼鱼卵的致死性的鉴定分别用活菌以及灭活的海分枝杆菌对斑马鱼胚胎进行注射感染实验，同时设置注射液为含2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)的PBS溶液的对照组。1．2．4斑马鱼胚胎的感染及治疗将感染后的斑马鱼鱼卵收

3、集到90×90mm的培养皿中，每个培养皿最多放置200个卵。一天后对收集到的卵进行分组，每组为25只卵，然后分别用不同浓度的利福平以及异烟肼进行治疗。同时设置注射液为含2％的聚乙烯毗咯烷酮(PVP40)的PBS溶液的对照组。1．2。5注射菌液的细菌计数对斑马鱼胚胎进行注射的过程中，按照每次注射的量进行留样然后涂平板，待长出茵落后进行菌落计数。2．结果2．1海分枝杆菌对斑马鱼鱼卵的致死性．分别用活菌以及灭活的海分枝杆菌对斑马鱼胚胎进行注射感染实验，结果如图2所示，活菌注射组与灭活菌注射组以及对照组相比，致死率明显，而灭活茵注射组与对照组相比，致死率

4、没有变化。图2活菌以及灭活的海分枝杆菌对斑马鱼胚胎进行注射感染Fi92InfectionofzebrafishembryoswithMycobacteriumstrainMliveordead2．2海分枝杆菌BAA．535的致死剂量用OD600值不同的海分枝杆菌注射液对斑马鱼进行感染，并对感染菌液进行菌落计数，观察不同海分枝杆菌注射剂量与斑马鱼死亡率之间的关系。结果如图3示，在注射剂量为27CFU与98CFU之间，不同海分枝杆菌的注射剂量之间斑马鱼的致死率没有明显的区别。图3海分枝杆菌BAA．535的不同剂量对斑马鱼进行感染Fig3Infecti

5、onofzebrafishembryoswithdifferentconcentrationsofMyeobactefium$lrainM2．3异烟肼对被感染的斑马鱼鱼卵的治疗作用对收集的被海分枝杆菌BAA-535感染的斑马鱼鱼卵进行分组，并用异烟肼治疗后，结果如图4示。结果表明足量的异烟肼对被海分枝杆菌BAA．535感染的斑马鱼鱼卵的具有明显的治疗作用，可以显著的降低被感染斑马鱼胚胎的死亡率，但是结果同样显示当异烟肼浓度高于lmM时，药物本身会显示其对斑马鱼胚胎的致死毒性。·158·图4异烟肼对海分枝杆菌BAA．535感染的斑马鱼鱼卵的治疗Fi

6、94Infectionofzebrafishemb可oswithMycobacteriumstrainM(OD=1)andtreatedwithdifferentconcentrationsoflsoniazid．2．4利福平对被感染的斑马鱼鱼卵的治疗作用对收集的被海分枝杆菌BAA．535感染的斑马鱼鱼卵进行分组，并用利福平治疗后，结果如图5示。结果与异烟肼类似，足量的利福平也可以对被海分枝杆菌BAA．535感染的斑马鱼鱼卵的具有明显的治疗作用，口J以显著的降低被感染斑马鱼胚胎的死上率。同时结果也显示利福平对斑马鱼胚胎没有类似异烟肼的毒性作用。图

7、5利福平对海分枝杆菌BAA．535感染的斑马鱼鱼卵的治疗Fi95InfectionofzcbrafishembryoswithMycobacteriumstrainM(OD=1)andtreatedwithdifferentconcentrationsofrifampicin3．讨论虽然抗结核一线药物和一些抗结核二线药物的联合用药可以有效治疗由药物敏感菌感染引起的结核病，然而随着耐多药结核病以及广泛耐药结核病的不断涌现所以，发展新型抗结核药物，特别是抗耐药结核分枝杆菌的新型药物迫在眉睫。由于结核分枝杆菌生长缓慢，而且药效学评价工作的开展受到生物安

8、全性的极大制约，因此抗结核药物研发的一个重要瓶颈就是缺乏理想的动物模型。小鼠以及豚鼠无法完全模拟出结核病损伤在人体中关键过程，例如肉芽肿