pi3k2fgsk3β信号通路介导心肌营养素1对心肌细胞缺氧复氧损伤的作用

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1、摘要目的：通过研究体外培养的心肌细胞，利用心肌细胞急性缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤，通过观察CT-1(Cardiotrophin一1)对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率，心肌细胞凋亡，心肌肌酸激酶，线粒体模电位(a1l，m)等的影响，探讨cT一1在心肌细胞缺氧复氧损伤中所起的作用及机制，通过CT一1信号通路PI-3K／GSK3B阻断剂LY294002干预，从分子水平阐明PI一3K／GSK3B介导心肌营养素一1对心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用。方法：1．乳鼠心肌细胞培养：取出生1-3天的SD大鼠心肌组织，按改良的S

2、impson等方法进行分次水浴搅拌消化，差速贴壁法纯化心肌细胞，以1×106／om2的细胞密度接种于35mm培养皿。2．缺氧复氧模型的建立：心肌细胞生长接近会合状态，呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液配制缺氧液，以95％N：一5％C0：预饱和1h，将培养的细胞经缺氧液缺氧3h，之后换成复氧液培养3h。3．实验分组：(分5组)(1)对照组：更换培养基后CO：孵箱中正常培养；(2)缺氧复氧组：缺氧3h，复氧3h处理；(3)缺氧复氧+CT一1组：缺氧3h后，加CT一1(10ng／m1)进行复氧3h处理；(4)缺氧复氧+C

3、T-l+LY294002组(P13K／GSK3B阻断剂)：缺氧3h，加入终浓度为lOumol／1的LY294002，lOmin后加C，I．-1(10ng／m1)，再进行复氧3h处理；(5)缺氧复氧组+CT—I+DMSO组：缺氧3h，加DMSO(助溶剂)lOmin后加CT一1(10ng／m1)，进行复氧3h处理。结果1．心肌细胞搏动频率与节律：各组基线心肌细胞搏动频率均为148次／分左右，各组无明显差异，节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率教复氧前明显减缓，搏动幅度减弱，节律不规整。CT-I处理组搏动频率与缺氧复氧前比

4、较无明显减慢，与对照组相近，节律整齐。而阻断剂LY294002干预后，频率明显减Il摘要慢，搏动幅度减弱，节律明显不规则，而助溶剂DMSO并不干扰CT一1的作用。表明LY294002特异性阻断了C1’一1对缺氧复氧损伤的心肌细胞的保护作用。2。心霆蘧细胞的损伤：对照组心肌细胞存活率为96．2--+3．2％，凋亡率为2．8-+O．4％。缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低，为76．8±4．6％，心肌细胞凋亡率明显上升(19．4士2．3％)，二者差异有显著意义(P

5、1处理的心肌细胞，明显抑制LDH，CK-船的升高和凋亡的增加，存活率较缺氧复氧组明显升高(89．8±8．3％VS78+8±4．6％，P

6、是50．13±5．82VS69．13±6．84，54．51±6．62VS69．13±6．84，P均

7、。197±0．029VS0．986±0093，PO．05)，表明CT一1激活了P13K途径使磷酸化P13K蛋白水平表达舞高。5。心肌细胞GSK38蛋自表达和磷酸化状态：各组经3小时缺氧，3小时复氧压，心肌细胞GSK3B蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化GSK3B蛋白表达明显减少，而CT一1组较缺氧复氧组显著上升，加P13K／GSK3B阻断剂后磷酸化GSK3§蛋白表达明显减少，而劲溶剂组与CT-1

8、组无明显差异，表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞磷酸化的作用，P13K／GSK3B阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。6．心舰细胞Caspases3蛋白表达：各组蛋自上样量无明显差异，经缺氧复氧后，缺氧复氧组较空自对照组Caspases3蛋自表达明显升高(0．953±0．015VS0．329±0．017，P