ampk在氯离子介导心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

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1、南昌大学硕士学位论文AMPK在氯离子介导心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用姓名：孙惦申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：何明201206摘要舢舢Ⅷ咖洲ⅢⅢⅧ洲删Y2157835目的：在调节心肌能量代谢过程中，AMPKa2起着非常重要的作用。本实验拟建立H9c2细胞缺氧／复氧(A瓜)及去除细胞外Cl‘的刖R(C1一．舶e刖R)损伤模型，探讨AMPK0【2低表达在氯离子介导心肌细胞A瓜损伤中的作用，以便进一步研究心肌AR损伤机制。方法：运用RNA干扰技术，以pSuper．Re仃。为载体，构建AMPK0【2sⅪ斟A重组质粒。通过质粒转导，建立AMPK0【2正常表达和低表达的心肌细胞(H

2、9c2)，westemBlot法测定AMPKa2的蛋白表达情况。实验分五组，每组重复6次：(1)正常对照组；(2)刖R组；(3)去除细胞外Cl’的A瓜组(Cl。一ne～R)；(4)pSuper+C1’一舶e～R组；(5)pS．AMPKOL2+Cl’一行eeA瓜。四唑盐(MTT)法测定各组心肌细胞存活率；测定各组抗氧化物酶SOD、乳酸脱氢酶LDH、谷胱甘肽过氧化物酶GSH．Px的活性；流式细胞仪测定各组ROS水平、线粒体膜电位、细胞凋亡程度。结果；1．经过酶切鉴定及基因测序结果证实：AMP‰2sI州A干扰质粒重组成功；2．WestemBlot检测表明：重组质粒能有效下调H9c2中A

3、MPKQ2蛋白表达；3．正常H9c2细胞经AR处理后损伤严重，去除细胞外Cl一的刖R组有明显对抗A瓜导致的细胞存活率、SOD、GSH．PX酶活性下降，对细胞起保护作用；而AMPK低表达组中Cl一．疳ee对细胞的保护作用明显消失，细胞存活率、SOD、GSH．PX酶活性、线粒体膜电位下降，细胞内ROS含量、LDH活性升高，细胞凋亡程度明显比Cl‘．丘eeAR组严重(P<0．01)。pSuper+Cl’．行eeA瓜组与Cl’．丹eeA瓜组相比，各指标无明显差异(P>0．05)。结论：AMPKa2参与了去除细胞外氯离子(Cl。一舶e)对抗心肌急性缺氧／复氧损伤的作用，AMPKQ2基因沉默

4、使C1’．行ee在心肌细胞缺氧／复氧中的保护作用消失。关键词：AMPKOL2，氯离子，缺氧／复氧，RNA干扰国家自然科学基金资助项目(NO：30860271)Abs仃actABSTRACTobjective：AMPKa2playsaVeryene喑ymetabolism．Weestablishedt11eimportantroleinregulatingmyocardialanoxi“reoxygenationirljurymodelandC1一．行eeA／Rinjurymodelt11atC1．inpermsionsolutionwasr印laced谢thequimolar西u

5、conate-duringtheA／RprotocolofH9c2myocytestoexploremeroleofAMPKa2lowexpressioninacuteA瓜iIlju巧mediatedbyCl。．AndinordertomrcllersnldytllemechallismofA／】Rinjury．Methods：ThepSuper．RetroplaSmidconsideredasVectorwasusedtocons饥lcttheAMPKOL2shRNArecombinantplaSmidbyRNAinterferencetecⅢque．Weesta_blishe

6、dmenomlalexpressionaIldlowexpressionlevelsofAMPK0【2proteininH9c2cellsbygene仃a11sfectiontechIlique．TheexpressionofAMPK0【2wausaSsayedbyWeStemB10taIlmyses．nleH9c2cellswereraJldomlydiVidedintofiVegroups：(1)Con仃olgroup；(2)A瓜group；(3)remoValofex仃acellularCl‘+A瓜group(Cl。-舶eA瓜group)；(4)pSuper+C1‘一舶eA

7、瓜伊oup；(5)pS-AMPKOL2+Cl一-丘eeA瓜伊oup．Everygroupr印eatssixtimes．ThenCellViabili锣wasaSsayedbyMTT，aIldSOD，LDH．GSH．PxactivitvinH9c2weredetected．’I’llelevelofintracellularROS，thepercemageof印optosisa11dt11emitochondriamembranepotential、veremeasuredbyno