尿毒症患者血管钙化的组织学研究及相关分子机制的探讨

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1、囊寨薤麓夫学薅圭学经速文中文摘要第—部分乐毒藏患者棱渤脉钙化与洳sM_A及0P亵达关系的研究辩蓊观察尿毒症患者桡动脉钙化的组织学特点及早滑肌肌动蛋白．旺(洳SMA)争骨橙蛋鸯(op)的表达变化，并探讨影响血管改变酶相关因素。方涤30例尿毒症患者，于动静脉内瘘术中取小段桡动脉。用vonKossa染色观察动脉钙化的情况，免疫纽化研究中层平滑肌肌动簧白一程<氆一sMA)和骨梅蛋白(op)的表达，并和正常对照组进行比较。繁荣正常桡动脉无钙化，平滑肌细胞排列整齐，免疫组化显示cc．SMA表达丰富，几乎无OP的表迭。在30例尿毒症患者申，ll例(36。67％)

2、斑税桡动脉钙化，主要局限于平滑飘层，其中6饲(20％)轻、中度钙化，5例(16．66％)莺度钙化，19例(63．33％)未见明鼠钙化。血管钙化与血钙、磷及钙磷乘积水乎密切撩关(PO．05)。在l】例钙化的血管，平滑鼹麴藏排列紊乱，毡。sMA表达减弱甚至缺失，停饼·表达量增加，且0【一SMA、0P的变化与血管锅化的严重程度有关(p

3、京隈科大学博士学位论文结论尿毒症患者桡动脉钙化主要发生在血管中膜，钙化的严蜜程度与血磷及钙磷乘积水平、2型糖尿病史有关。平滑肌细胞的标志蛋白程一s淞表迭减少、管基壤蛋蠹0P分泌增多与血管钙化镌关系密切，说明尿毒症特殊的内环境使平滑肌细胞失去了原有的生物学特点，具有类似成骨样细胞的功能。关键阔尿毒症；血管钙化；桡动脉；血管平滑肌细胞；平滑飙肌动蛋白一Gc；骨携蛋鸯第二部分高磷谤导体外培养姆人血管乎滑肌细胞向奏欲成营样细胞转分化的分子机树探讨目的探讨体外离磷培养的条件下，人血管平滑肌细胞转分化的特点和分子机制；分析转化生长阁子p1(Transfornl

4、inggro讹factor_p1，弼F。舀1)在这一病j璧过程中的地位争作用。方法(1)鼹鳃织块然壁戆方法建立人主动脉血管平滑舰纽跑的体外培养技术；(2)用westemB10t的方法，分别观察在不同磷浓度(1，O删证，鸯裘暇科丈学博士学位论文2．5ntM，3．5mM)以及TGF—p1(1ng／ml、2ng矗n1)刺激的条件下，人血管平滑肌细胞在不同的培养时间藤，细胞自身标志蛋白Ⅸ-sMA以及成骨细胞相关蛋白(I型胶原、骨桥簧白和骨钙案等)表达的动态突化过程；(3)通过免疫荧光观察上述指标以及成骨细胞特异性的核转录因子Cb缸l的表达变化特点；(4)以

5、越酸银(vo珏Kossa)染包争茜素红染色?解高磷务停下细胞钙盐沉积的状况：(5)电镜观察离磷培养的条件下，钙化的血管平滑肌细胞的超微结构特点；(6)嗣疑stern8lot争免疫荧光的方法，分析齑磷务停下，人血管平滑肌细胞中TGF．B1的蛋白表达变化；通过ELIsA检测细胞上清液中活性TGF．D1的水平；(7)遥过弹NR观察高磷对血萤平滑瓤细胞TGF一§l的越埝}A表迭影响；(8)用westemBlot和免疫荧光的方法，分析在离磷的刺激下，细胞申TGF-pl的I裂受体(T6融)的表达变化；(9)通过中争抗俸阻颦纽胞肉粥F．圣l的诈廷，以T阻、cb缸

6、】、FN和I型胶原为观察指标，分析高磷对人血管平滑肌细胞生物学效应的变化。惩果(1)在无血清培养的条件下，高磷(2．5mM)和TGF．p1(1ng／m1)分别刺激人血管平滑肌细胞12小时后，胞内Cb敞1的表达就明显上南京睡科大学博士学位论文升，且迅速从胞浆转移到胞核，提示VsMc开始具有类似成骨样细胞的生物擘特性；(2)高磷组舜口TGF一6l组的细胞在无血清培养3天后，I型胶原、纾缎连接蛋白和曹桥蛋白的表达均曝艇上调；在合15％髓牛血清砖营养液中培养的第6天，两缎细胞中骨镪素的产量开始增加；第12天，用TGF．Bl刺激的细胞中仪．sMA的表达下降，

7、而高磷纽产生类似现象需要15天；(3)在2．5mM秘高磷环境下培养15天后，硝酸银染包和茜素红染色显示，细胞出现多处斑片状鲢钙盐沉积；电镜可见施浆内产生大量胶原纤维和钙化的基质囊泡；(4)在正常无血清的培养条件下，人血管平滑肌细胞的上清液中几乎不舍活憾TGF．B1，当用2．5mM的高磷刺激6小时后，上清液中粥F一瑟l鼹水平增至0．28n咖l，在篷君魏察的24、48小时中，TGB8l的浓度基本保持不变；(5)当细胞在含15％胎牛血清的营养液中培养3天时，正常对照组的上清液中TGF—p1的基础浓度为O．16ng／m1，而离磷组TGF。D1的含量明驻增加

8、(2．5mM时为O．35ng／ml，3．5瑚M时为O．39ng／mI，与正常对照多藏搬比，p