sox2在肺癌发生和细胞凋亡中作用机制的研究

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1、中文摘要在世界范围内，肺癌的发病率呈持续增高的趋势并且居男女肿瘤病死率的首位。据统计2009和2010年，在所有肿瘤中肺癌的发病率和病死率仍然最高[1．2】，大部分的肺癌病人在初次确诊时已经处于癌症的晚期，因此造成了肺癌的高病死率[3]。2011年美国有221，130例新发肺癌病人以及有156，940例肺癌病人死亡[4]。在病理分型上，肺癌被划分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(腺癌、鳞癌和大细胞肺癌)，这一病理分型为治疗策略的选择和预后的评判提供参考的依据。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的比例超过85％，在初次确诊时大多数病人的原位肿瘤已

2、经为晚期并伴有肿瘤转移，而其中肺腺癌占非小细胞肺癌约60％．70％的比例。手术切除肿瘤是对于早期非小细胞肺癌治疗的主要手段[51，而对于不能手术切除肿瘤的病人，通常采用放疗和化疗的办法。对于小细胞肺癌而言化疗是主要的治疗方式，对一些处于特定临床分期的肿瘤也采取合并放疗的方式[5]。许多研究表明在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中都存在肿瘤干细胞样细胞[6．26]。这些肺癌干细胞具有高克隆形成性，可以形成肿瘤并且对化疗放疗都具有抵抗性。与其他许多癌症类似，肺癌的发病也由于癌基因的激活，或抑癌基因的失活[27]。肺癌细胞的异常生长是一个多基因参与，

3、涉及复杂的基因网络调控的过程，然而基因参与肿瘤生长并且在肺癌干细胞中的分子调控机制并不明确。因此，对肺癌分子调控机制的深入研究可提高肺癌病人的治疗质量。性别决定区域Y基因2(sexdeterminingregionY-box2，SOX2)，参与维持胚胎干细胞的多能性[28．29]，并且在多种器官发育过程中发挥作用，包括参与肺支气管的形成[30]。在肿瘤基因表达的研究中，分析在发育和分化中激活的基因结果表明，SOX2在低分化的肿瘤中高表达[31．32]。本文以SOX2为研究对象，通过各种实验手段，一方面阐明了SOX2分子在肺癌发生中的重要

4、作用，参与调控肺癌干细胞生长及其调节的分子机制。另一方面，在观察到沉默SOX2分子可引起肺癌细胞发生显著凋亡的基础上，进而深入的研究了其调控凋亡的分子机制。这些发现为我们研制以SOX2为靶点的可应用于肺癌治疗的有效药物奠定了坚实的基础。中文摘要首先，我们利用免疫组织化学染色的方法，对临床肺癌和正常肺组织标本进行了染色，分析SOX2在肺癌临床标本中的表达情况，发现SOX2在肺癌组织中的表达显著高于正常的肺组织，这一结果提示我们，SOX2在肺癌的发生中起重要的作用。其次，我们利用Hoechst33342对A549细胞进行染色并经过流式细胞仪

5、分选，分析SOX2在人肺癌细胞A549的侧群细胞中的表达，在RNA和蛋白水平都检测出SOX2的表达在侧群细胞中明显高于非侧群细胞，说明SOX2在维持肺癌干细胞的特性中发挥了重要的作用。通过上述实验结果，我们初步明确了SOX2在肺癌发生和维持肺癌干细胞特性中的作用。我们进一步通过慢病毒系统建立了可经Doxycycline诱导沉默SOX2的稳定细胞系，并运用NOD／SCID免疫缺陷小鼠建立了肺癌体内模型，探讨了SOX2在肺癌发生和凋亡中的作用及其分子机制。主要实验结果如下：1．沉默SOX2可显著下调A549细胞中侧群细胞的比例，并且导致在侧

6、群细胞中高表达的癌基因WNTl、WNT2、NOTCHl和c．MYC的表达量都明显下降，这一分子调控的变化在另一株人肺癌细胞系H460中可得到相同的结果。2．利用体内成像系统，连续动态的对小鼠体内肺癌细胞生长进行观察，沉默SOX2可显著抑制肺癌的发生，并且肺组织切片染色结果显示，癌基因WNTl、WNT2、NOTCHl和c-MYC在沉默SOX2实验组的肺癌组织中的表达量都明显下降。3．通过基因芯片分析，发现沉默SOX2可调控246个癌基因的表达发生变化，进一步揭示了SOX2在肺癌发生中的潜在分子机制。4．沉默SOX2可引起肺癌细胞系A549

7、、H460和H1299细胞死亡，通过AnnexinV和PI染色结果可知细胞发生了明显的凋亡。5．通过凋亡蛋白芯片分析，结合WesternBlot结果验证，沉默SOX2引发的凋亡是通过调控了凋亡的线粒体途径和死亡受体途径共同作用发生的，并且SOX2调控表达变化最为显著的蛋白是p53的表达和磷酸化水平的上调、Bax和Bad分子的表达增加，caspase3和caspase8分子的激活。6．Real．timePCR和WesternBlot结果显示，沉默SOX2可引起RAS／MAP激酶通路的分子表达量上调，并且激活凋亡通路中的两个重要的诱发因子p

8、53II中文摘要和TNFa，并且下调Survivin的表达。7．在沉默SOX2的同时沉默RAS或MAP4K4分子或者过表达Survivin都能明显的抑制凋亡发生的程度，经AnnexinV和PI染色结果可知，