i型鸭肝炎病毒单克隆抗体制备

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1、摘要．鸭病毒性肝炎(DuckViralHepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(DuckHepatitisVirus)引起的以侵害雏鸭为主的高死亡率的烈性传染病。DHV有三个型，分别命名为DHV．1、DHV．2和DHV-3，三个型之间没有抗原交叉性。其中以传统l型DHV分布最广泛，对3周龄内的雏鸭致死率高达90％以上。目前，2型和3型DHV只在中国、英国和美国有相关报道，但致死率较低。目前我国较为流行的DHV属于l型DHV(DHV．1A)。DHV．1属于小RNA病毒科，小RNA病毒属，是单股正链RNA病毒。该病毒颗粒比较小，大小只有20nm左右。本研究将DHV-1进行增殖和纯化，

2、利用纯化的DHV-I免疫小鼠，最终制备出lO株抗DHV-I的单克隆抗体。本实验将DHV-1接种鸡胚，收取24h"--96h死亡鸡胚的尿囊液。经过氯仿抽提后将病毒用PEG-6000进行浓缩，浓缩后的病毒悬液以5x104Xg的速度进行离心16h。将纯化的DHV-l免疫6周龄的BALB／c雌鼠，取小鼠的脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞在PEG-1450的作用下融合。利用间接ELISA方法进行筛选和三次亚克隆，最终得到10株抗DHV．1的单克隆抗体，分别命名为AF8(线性)、BD6(线性)、AF2、AF3、AD4、AE2、AGl、DB6(线性)、BG6和DHll。并对该lO株单克隆抗体的效价、

3、特异性、稳定性、亚型、腹水效价和中和活性进行了鉴定。结果表明：lO株单克隆抗体的细胞上清效价高达l：2048，腹水效价高达1：409600：传代25代和冻存6个月以后，将杂交瘤细胞上清进行ELISA检测，发现细胞分泌抗体的能力稳定性较好；其中有8株杂交瘤细胞分泌的抗体类型为IgG!，2株杂交瘤细胞分泌的抗体类型为IgM，轻链类型均为K链；利用ELISA方法对其特异性进行检测，结果显示10株单克隆抗体有6株单克隆抗体与DHV-1C产生交叉反应，但与SPF鸡胚尿囊液、呼肠孤病毒和鹅细小病毒没有交叉反应，特异性较好。抗DHV-1单克隆抗体的成功制各为今后建立快速敏感的DHV-I诊断方法奠

4、定了基础，也为DHV．1蛋白结构和功能的研究以及病毒的分子致病机理提供有利条件。关键词：鸭肝炎病毒，单克隆抗体，ELISAAbstractDuckHepatitisVirus(DmOisthecausativeagentofDuckViralHepatitisfDVH),anacuteandfataldiseaseofducklings．ThreetypesofDHV(DI-IV-1，DHV-2andDnv-3)showednOcrossreactionamongthem．TraditionalDHV．1isthemostwidelydistributedand啪causemore

5、than90％mortalityinducklingsunder3weeksofage，whileDI-IV-2andDHV·3铂℃onlyreportedinChina,t／K,andtheUSAwithlowmortality．DHV-1AisthemOStpopularserotypeinChina．WhichbelongstopieornaviridaewithsingleRNAstrandandabout20lirainsize．InthissIudyIpthepuri6酣DI-IV·1w勰usedtoimmunizemicetoproducemonoelonalanti

6、bodies．10monoclonalantibodiesagair,stDI-1V-1Welt屯obtained．ThesemonoelonalantibodiescouldbeusedtodevelopearapiddiagnosticmethodforDHV—linfectioninthefuture．Chickenembryos、Ⅳe他usedforviruspropagation．AUantoiefluidwerecollectedatter24h'---96hinfectionOrwhenelaiekenembryosdied．Afterfreezingandthawi

7、ngfor3times,thevirusWaSextractedwithclaloroformandthenconcentratedwithPEG-6000．11艟ultraeentrifugationWaSoerformedfor16h砒5x104Xg．啊1epurifiedantigenw笛usedtoimmunize6-week-oldfemaleBALB／cmice．1f1圮spleencellsofimmunizedmicewerefusedwithSP2／