fitc标记蛋白质

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1、FITC标记蛋白质ProductNumbers:Synonym:FITCAppearance:yellowpowderStorageTemperature2-8°CMolecularFormula:C21H11NO5SMolecularWeight:389.4Excitation:λmax=495nmEmission:λmax=525nmFluoresceinisothiocyanate(FITC，异硫氰酸荧光素)iswidelyusedtoattachafluorescentlabeltoproteinsviatheaminegroup.Thei

2、sothiocyanategroupreactswithaminoterminalandprimaryaminesinproteins.Ithasbeenusedforthelabelingofproteinsincludingantibodiesandlectins.FITC-N=C=S + N-H2-protein  → FITC-NH-S-C-N-H-proteinPreparationInstructionsFITCistestedforsolubilityandsolutionappearanceat1mg/mLinacetonetogi

3、veaclearyellowsolution.Itissolubleinanhydrousdimethylsulfoxide(DMSO)at5mg/mL.Itissolubleinwateratlessthan0.1mg/mLinwater,at20mg/mLinethanolandat9mg/mLin2-methoxyethanol.Anorganicsolventforstocksolutionisadvised,sinceFITCdecomposesinwater.FITCisdilutedinbasicbufferforcouplingpr

4、oceduresimmediatelypriortouse.Storage/StabilityTheproductsarelight-sensitive,andshouldbestoreddryandinthedarkat2°Cto8°C.ProcedureofLabelingProteinwithFITC1.Preparationbeforeexperiment:1)配100mL，0.1MPH=8.5的SB缓冲液(0-5℃保存，且不超过一周，最好现配现用)；2)准备好A,B,C,D四个石英比色皿；3)取一小容量瓶，事先用锡箔纸将其完全包住以避光；

5、4)用超纯水注满D=15mm，L=300mm的柱层析分离吸附柱，过夜浸泡，同时检测其是否漏液，第二天再用PBS浸泡7-8h；5)用DIW浸泡葡聚糖SephadexG-50过夜(1gSephadexG-50配5mLDIW)，使其溶胀，打开孔状结构；而后将DIW倒掉，注入适量PBS(PH=7.4)，用锡箔纸盖好防灰，4℃保存；注：(1)SephadexG-50量可以过多，过完柱层析分离吸附柱后剩余部分可加入0.02%(m/v)NaN3，防止细菌，保存于4℃冰箱中；(2)SephadexG-50第一次配好后可以反复使用多次，但应做相应后处理(见后)；(3

6、)SephadexG-50分离范围：1000-30,000(分子量)，1.计算Protein中游离-NH2，配制1.0mg/mLProtein/SB蛋白溶液：BSA,FraktionVMw=67000Da,Arg26个;lys60个;20mgBSA;2mLSB(0.1MPH=8.5)；游离-NH2：n1=20×0.001g×(26+60)/(67000g.mol-1)=2.57×10-5mol；溶于小容量瓶中(外包锡箔纸避光处理)，加搅拌子搅拌，使其完全溶解；注：组成蛋白质的20中氨基酸中，仅Arg，lys在侧链上有游离的-NH2。3.求算FITC

7、的量：5.8mgFITC，5.8mLDMSO(干燥)，溶于5mL冻溶管中；注：(1)配好后分装于0.5mL离心管中，-69°C保存，之后可以直接使用。(2)FITC的量应适中，以使蛋白质中所有游离的-NH2均与FITC反应，FITC量较少→未反应-NH2较多→F/P低；FITC量过多→F/P高；(2)对BSA，取已配好的150uL1.0mg/mLFITC/DMSO，故FITC：n2=0.15×1.0×0.001/389.4mol=0.385×10-6molDissolvetheFITCinanhydrousDMSOat1.0mg/mL.Note:T

8、hisshouldbepreparedfreshforeachlabelingreaction.4.FITC标记Prote